大電導鈣激活鉀通道功能調控機制的研究進展

朱 倩 (浙江海寧市人民醫院 314400)

大電導鈣激活鉀通道(也稱作BKCa，MaxiK或Slo-1)是鉀離子通道家族重要的成員之一。它具有大單通道電導、分布廣泛、受膜電位和胞內鈣離子雙重調控等特點，參與許多重要的生理活動。

BKCa通道是由四個形成孔道的α亞基聚集而成的對稱復合物，在很多組織中由α亞基和β亞基組成，β亞基對通道的功能起調節作用。BKCa通道的α亞基的N端有7個跨膜區段(S0～6)，COOH端包含4個疏水區段(S7～10)，這一區段對通道的調節起著十分重要的作用。S7～8區段有兩個鉀電導調節區(RCK)，在S10區段前有一系列保守的帶負電荷的天冬氨酸殘基，是鈣離子結合的位點，稱為“鈣池”。此外，在COOH端還有其他的一些調節位點，如四聚化位點、磷酸化位點、鎂離子結合位點等。在不同組織中，BKCa通道的功能特征有顯著的差異，其功能受很多機制所調控，本文就近年來在這方面的研究進展作一綜述。

1 β亞基及其他輔助蛋白的調控

在哺乳動物中，已有4個β亞基（β1～β4）被克隆。盡管β亞基之間的同源性很高，但它們的表達譜及對BKCa通道功能特征的影響有顯著的差異。β1主要在平滑肌、毛細胞和某些神經元中表達，通過改變亞基電壓感受器的構象及其移動來減慢BKCa通道的門控，并增加通道對鈣的敏感性[1]。此外，β1的共表達能改變鈣離子對α亞基中兩個主要鈣結合位點的親和力，當通道開放時，鈣離子對RCK1的位點親和力增加，而在關閉時，對“鈣池”的親和力則下降[2];β2則能加速BKCa通道的失活；β3在睪丸、胰腺和脾臟中表達，也能加速BKCa通道的失活，但不影響通道對鈣的敏感性；β4在大腦中的表達最高，能減慢通道的失活，改變通道的鈣依賴性電壓－電導關系，并且能使BKCa通道對阻斷劑IBTX和ChTX的敏感性下降。當β4亞基和α亞基共同形成通道時，通道口的靜電作用及空間位阻可阻止ChTX的進入，從而使通道對阻斷劑的敏感性下降。有研究顯示，β4胞外區中四個連續的賴氨酸殘基和BKCa通道中央孔道的胞外入口很近，它們組成三個帶正電荷的環，能降低胞外鉀離子濃度，以賦予BKCa通道的外向性整流特征[3]。Martin等[4]報道，β4能調節BKCa通道對酒精的反應，當α亞基和β4亞基在HEK293中共表達時，BKCa通道對酒精的急性耐受性會顯著下降；從β4亞基敲除的小鼠中分離的神經元中的BKCa通道對酒精能產生快速耐受性，因此β4亞基有可能成為治療酒精中毒的一個靶點。

除了上述4個β亞基外，其他一些輔助蛋白也能調控BKCa通道。研究者用酵母雙雜交的方法在果蠅中鑒定了兩個BKCa的調節蛋白Slob和dSLIP1。dSLIP1能減少BKCa通道在細胞膜上的表達，而降低BKCa通道的電流幅度；Slob本身對BKCa通道只有較弱的作用，但當它與另一種稱作14-3-3的蛋白共同作用時，可以顯著地抑制BKCa通道的活性。一種Mink相關肽MiRP3也可以調節BKCa通道，在CHO細胞中它可顯著減小BKCa通道的電流密度，并使通道的電壓－電導的關系曲線向更去極化的膜電位偏移[5]。在腎臟足細胞中，nephrin蛋白可調節BKCa通道的表面表達[6]。此外，BKCa通道的表面表達也受一種稱作MAGI-1的膜支架蛋白抑制，MAGI-1可能在腎臟及大腦等組織中調節BKCa通道的活性。大多數關于β亞基及輔助蛋白對BKCa通道的研究結果來自于離體的異源表達系統，且近年來的研究還發現BKCa通道的某些β亞基及輔助蛋白對其他的鉀離子通道也有調節作用。因此，β亞基及輔助蛋白對BKCa通道在體內調節作用的特異性仍有待于進一步驗證。

2 磷酸化調控

在神經、肌肉及非興奮性細胞中，離子通道功能結構的多樣性是電信號變化的基礎，蛋白磷酸化是產生這種多樣性的重要機制之一。許多離子通道的內在門控特征受細胞中磷酸激酶和磷酸酶的調控，這些酶可以通過修飾通道蛋白中某些特定的可逆性磷酸化位點來動態調節通道的活性。BKCa通道是各種常見的絲氨酸/蘇氨酸激酶的重要底物之一，這些酶包括cAMP依賴性蛋白激酶A(PKA), cGMP依賴性蛋白激酶G(PKG)以及二酰基甘油/Ca2+依賴性蛋白激酶C(PKC)等。這些激酶可使BKCa通道的活性與細胞的各種信號級聯反應相關聯，以控制細胞的興奮性或收縮性。Tian等[7]報道，哺乳動物BKCa通道α亞基的所有剪接體都含有一個保守的PKA位點，此位點位于C端“鈣池”序列附近，通道所有4個亞基在該位點的磷酸化可使其活性提高60%。Yan等的研究[8]顯示，BKCa有至少7個選擇性剪接體，他們鑒定了多達30個的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點，且通過在HEK293細胞中的電生理實驗，證實了BKCa通道α亞基的磷酸化能差異性地調節通道的電壓和鈣的敏感性，提示BKCa通道α亞基的動態磷酸化修飾可能為哺乳動物中樞神經系統中神經元的興奮性的控制提供一種分子機制。

BKCa通道的活性也可受Ca2+/鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的調控，在用秀麗線蟲為模式動物的一項研究中發現，在神經肌肉接頭的突觸前膜中，CaMKⅡ能通過直接磷酸化線蟲BKCa通道的蘇氨酸殘基T425調節其功能，進而控制神經遞質的釋放[9]。Liu等[10]報道，CaMKⅡ能通過磷酸化N端的T107抑制牛BKCa通道的活性，并改變通道對酒精的敏感性。在中樞神經中，CaMKⅡ被認為是記憶和學習過程中的關鍵分子，它對BKCa通道的作用提示了BKCa通道可能參與神經元可塑性的調節。

除了α亞基，通過β亞基或其他輔助蛋白的磷酸化也能調節通道的功能。有研究指出，當BKCa通道在HEK293細胞中表達時，其活性與內源性的酪氨酸激酶和磷酸酶密切相關，而這種相關性依賴于通道的接頭蛋白cortictin的可逆性磷酸化，表明BKCa通道的活性受cortictin磷酸化狀態的調節[11]。

3 mRNA 選擇性剪接的調控

在不同物種中，BKCa通道的α亞基都有很多的選擇性剪接體，其中有些能產生具有顯著鈣敏感性及動力學差異的通道，以行使不同的生物學功能[12]。在耳蝸的毛細胞中，不同剪接體編碼的通道能在毛細胞的基膜形成一種鉀電流的梯度，調節毛細胞中電壓共振的頻率。這些通道在動力學上有顯著的不同，它們與電壓門控的鈣通道的組合，在很大程度上決定了毛細胞的電學調諧。在小鼠的發育過程中，中樞神經系統中BKCa通道的不同剪接體的豐度有很大變化，說明哺乳動物在大腦發育過程中，需要具有不同特征的BKCa通道來行使功能。Soom等[13]報道了在原始的大腦組織中，BKCa通道中編碼S6至RCK1區段的外顯子可以被一個同樣大小的外顯子取代，而通道的門控特征也發生了變化，在低鈣時通道能被更快激活，而在高鈣時其開放頻率增加。

外顯子選擇性的剪接還能作為一種分子開關來決定該通道的磷酸化調控的特性。研究顯示，PKA能通過磷酸化保守的S869而激活通道，但如果通道中包含外顯子STREX時，又能通過磷酸化其中的一個殘基來抑制其活性。因此，外顯子STREX成了BKCa通道在PKA激活型和PKA抑制型之間轉換的分子開關，這種外顯子選擇性剪接和磷酸化修飾的組合大大豐富了BKCa通道活性的調控模式[14]。

過去十幾年的研究已確立了BKCa通道在生物體對酒精耐受性的產生中起重要的作用[15]。例如在視上核及紋狀體中，BKCa通道對酒精的敏感性會逐漸下降。有研究發現[16]，BKCa通道對酒精敏感性下降是由一種含有稱作ALCOREX外顯子的mRNA的選擇性降解所引起的，這種ALCOREX mRNA的選擇性降解提高了其他剪接體的相對比例，使形成的通道對酒精不敏感；mRNA的選擇性降解是由microRNA miR-9所介導，在ALCOREX mRNA的3，-UTR中含有miR-9的識別序列，酒精可以使miR-9的豐度上調，從而使ALCOREX mRNA得以選擇性的降解。mRNA選擇性剪接的調控在很大程度上豐富了BKCa通道的生物學功能。

4 內源性代謝物的調控

近年的研究指出，BKCa通道的功能可被許多內源性代謝物調節，其中包括氧化亞氮(NO)、一氧化碳(CO)等氣體信號分子，4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)、血紅素等。例如，在海馬CA1錐體神經元中，慢性間歇性組織缺氧可顯著降低BKCa通道的開放頻率，這種BKCa通道的活性下降是由NO的不足引起，表明NO的缺失可抑制BK的活性[17]。在培養的人臍血管內皮細胞中，CO可直接或通過NO及cGMP依賴性途徑激活BKCa通道。在HEK293細胞中，CO能可逆性地作用于BKCa通道的S9-S10區段，以濃度依賴性方式快速激活BKCa通道，但不影響通道的單通道電導和去激活[18]。PIP2能直接調節BKCa通道的功能，通過增加鈣驅動的門控過程并改變通道開關，但不影響通道的單通道特征和電壓依賴性，這種作用能被β1亞基顯著加強[19]。血紅素能結合BKCa通道，抑制其活性。氧化型及還原型的血紅素都能直接與BKCa通道結合，降低通道的開放頻率。后來的研究發現，血紅素是CO作用于BK通道的受體，CO能結合還原型血紅素，使其由通道抑制劑轉變成激活劑，這揭示了氣體信號分子調節離子通道的一種新機制[20]。在氣管平滑肌細胞中，白細胞介素IL-4能通過快速增加近膜鈣離子的濃度來調節BKCa通道的功能[21]。此外，在血管平滑肌中，BKCa通道能被前列腺素、過氧化氫及脂質加氧酶產物等內源性代謝物所激活，從而使血管平滑肌超極化而舒張[22]。以上這些研究揭示了內源性代謝物對BKCa通道調節作用，為尋找新的治療心血管疾病的藥物提供了分子基礎。

5 其他調控機制

BKCa通道蛋白中含大量對很多氧化劑敏感的半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)殘基。半胱氨酸特異性還原劑二硫蘇糖醇(DTT)能加快BKCa通道激活的動力學過程，增加單通道開放概率。過氧化氫等氧化劑可選擇性地氧化半胱氨酸殘基，抑制BKCa通道的鈣依賴性激活，這種抑制性效應部分由C末端911位的半胱氨酸殘基氧化所介導。除了C911外，對RCK區段C430的氧化修飾也能改變BK通道的鈣依賴性激活。Zhang等報道[23]，BKCa通道的C430和C911殘基與撕裂膜片中通道的時間依賴性衰減有關，而給予還原劑DTT可以阻止這種衰減。此外，RCK區段中三個蛋氨酸殘基(M536、M712和M739)的氧化能增加BKCa通道的活性[24]。

某些離子通道也能調節BKCa通道的活性。在血管平滑肌細胞中，瞬時受體電勢(TRP)通道TRPV4能與BKCa通道及ryanodine受體形成鈣信號復合體，通過鈣誘導的內鈣釋放以引起平滑肌細胞的超極化和血管舒張。在培養的人支氣管內皮細胞系中，TRPV4與BKCa通道的功能相耦合，鈣離子通過TRPV4激活BKCa通道[25]。在腎臟足細胞中，BKCa通道能與內源性TRPC3和TRPC6結合，在HEK293細胞中共表達時，TRPC6能增加BKCa通道的表面表達及電流幅度，提示TRPC通道可能作為激活BKCa通道的鈣源之一來調節其活性[26]。在血管平滑肌細胞中，TRPC1能與BKCa通道結合，通過TRPC1的鈣離子可激活BKCa通道而引起細胞膜超極化[27]。上述研究表明，在平滑肌細胞中，TRP通道的存在為BKCa通道的功能調節提供了一種新的機制。

6 結語

BKCa通道的獨特之處在于一方面它對鉀離子的高通透性，另一方面它結合了電壓門控和配體門控離子通道的功能結構特點，因而可以受很多因素的調控。BKCa通道廣泛表達于神經元、平滑肌、內分泌等組織器官中，對細胞中各種信號的整合、細胞興奮性的控制、細胞內鈣離子的動態平衡等方面起重要的作用。BKCa通道的缺失能導致神經系統、心血管系統、呼吸系統的多種疾病，包括癲癇、運動障礙、聽力損傷、高血壓疾病、哮喘等。近年來，科學家們利用分子生物學、遺傳學、生理學等實驗方法，發現了更多的組織特異性BKCa通道α亞基形式及一些新的輔助蛋白，有關BKCa通道功能的調控機制正在被進一步揭示。這些研究將對尋找新的藥物靶點和治療相關疾病提供重要的理論依據。