分子細胞遺傳學技術應用于產前診斷的新進展

劉晗 綜述 李東至 審校

（廣州市婦女兒童醫療中心，廣東 廣州 510180）

細胞遺傳學是產前診斷中的一個重要組成學科，也是研究胎兒畸形、死亡及嬰兒出生缺陷原因的一種重要手段。根據研究指標和孕周可以選擇抽取羊水、絨毛（chorionic villus，CV）或是胎血等胎兒細胞用于細胞培養和染色體核型分析。羊水的核型分析準確性可以達到99.4%～99.8%，絨毛約為97.5%～99.6%。雖然傳統的細胞遺傳學技術可以準確地診斷各種染色體數目和結構異常，但是卻存在一定的缺點。一是精確度較差，這種方法不能可靠地檢測超過5萬～10萬個堿基對（Mb）或更小的基因組片段的缺失、重復或重排，也不能明確標記染色體的來源和端粒附近的細微重排［1，2］；二是核型分析的周期長，主要是由分析前細胞培養所需要10～14天的時間所決定的。為了有效克服上述缺點，學者們把分子生物學技術運用于細胞遺傳學中，使分子細胞遺傳學技術得以興起并較快地發展起來。本文對目前的分子細胞遺傳學技術進行綜述。

1 FISH

熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術是細胞遺傳學和分子技術的結合，它能確定特定DNA序列在染色體中的位置，雜交的基本原理是DNA雙螺旋之間的堿基互補。FISH技術有3個重要組成部分：探針、熒光和目標片段。同時有3個基本步驟：探針的制備、目標片段的準備和原位雜交。探針是DNA、RNA序列或1組在基因組中已知的序列，在一定的條件下特異性地與染色體上互補片段結合，未結合的探針將在隨后的洗滌步驟中被沖走，結合的探針最后在熒光顯微鏡下分析。

有若干種類的探針可以用來檢測染色體重排和非整倍體，例如，著絲粒特異性的重復序列探針被用于產前診斷，檢測常見的18、X和Y非整倍體［8］。這些探針也經常被用來確定標記染色體起源［9］。全染色體涂抹探針可以用于檢測中期核上的重排［10］；位點特異性探針，可在發現異常超聲結果的基礎上幫助診斷已知特定的缺失綜合征（如心臟缺陷和DiGeorge綜合征的FISH探針），或用于那些沒有著絲粒特異性重復序列探針的染色體（例如染色體13和21）。FISH打破了常規細胞遺傳學分析的諸多限制，提供了常見非整倍體間期快速核型分析平臺［3］，還可應用于異常染色體核型但需要進一步分子水平鑒定（例如標志染色體）。研究證明它是一種可行的診斷方法［4-6］。FISH已成為產前診斷中從細胞遺傳學角度全面分析染色體結構異常和標記染色體來源不可或缺的一部分［7］。多色熒光原位雜交（Multicolor-fluorescence in situ hybridization，MFISH）是一種染色體涂染技術。它將24種標記不同的人類染色體涂染探針同中期核細胞雜交，可以同時鑒別22對常染色體和2種性染色體，在一個中期核中每一種染色體的顏色都不同。這24種可以為人眼識別的偽色彩是由一套濾鏡和計算機軟件分配的。因而，M-FISH不需要額外的成像系統，它已普遍用于標記染色體、衍生染色體的來源定性，并能檢測微小平衡易位和復雜的染色體重排［11］。

但是，應用FISH技術通常要求患者有定義明確的綜合征的臨床表現并且是一種已知的染色體病。這是因為單個FISH探針只能檢測特定片段的重復，丟失或重排，而不提供余下基因組的其他信息。因此，著絲粒重復探針可能顯示一個標記染色體的染色體來源，但不能界定標記染色體上常染色質區域。同樣的，端粒探針可鑒定一個不平衡的移位，但是不能用單獨的FISH方法分析染色質丟失或重復的量。

2 SKY

光譜核型分析（Spectral karyotyping，SKY）是指以不同顏色顯示所有人類染色體的光譜成像技術。操作對24條特定染色體涂染探針同時雜交，每1個探針用1個或多個熒光素標記，可以單獨或組合應用。與基于濾鏡的技術不同，光譜成像生成1個干涉圖，圖像中每一種特定熒光或熒光組合都有特定像素，允許在單次曝光的情況下衡量整個圖像的發射光譜［12］。在光譜啟動后將雜交的中期染色體通過傅里葉分光鏡、CCD影像與光學顯微鏡捕獲并衡量所有染料強度，按照光譜的分類算法推出將特定顏色 （虛假顏色）分配給所有染色體，然后通過計算機影像軟件分析，不同的染色體顯示一種不同的虛假顏色，據此進行核型分析［13］。SKY自從在1996年首次被Seh rock發明以來，現在它已廣泛應用在產前診斷、生殖醫學、癌癥研究等領域。SKY技術使熒光原位雜交技術在異常染色體核型篩查的應用成為可能。SKY特點在于它使用光譜干涉儀檢測染色體信號，信號比M-FISH高（9～10倍），因而它的檢測準確性高于 M-FISH 。同時SKY檢測整個光譜，可以檢測到人眼不能區分的包含在低光的顏色信息，也可以提高染色體突變識別的準確性。SKY技術既可以篩選染色體異常，也具有FISH技術高靈敏度和高度特異性的特點，可以同時識別所有24染色體，并且鑒定長度在1～2 Mb的異常片段［14］。此外，它還可以判斷標記染色體和不平衡易位染色體片斷的來源、染色體復雜易位，以及微小的染色體畸變等等。

但是，M-FISH和SKY的探針都是由5種熒光團不同組合標記。如同全染色體涂染探針標記，高重復的DNA序列會被過多的非標記互補DNA抑制。因而，富含重復DNA序列的染色體區域，如異染色質區域和近端著絲粒染色體短臂區域都不能被這兩種方法涂染。染色體內小的缺失、重復或插入都可能由于這種方法的限制性被漏診［13］。

3 CGH

比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）可以全面的分析整個基因組。它能快速檢測正常與異常基因組DNA序列拷貝數的不同。CGH具有明顯的優勢，因為它是全基因組范圍的檢測，并沒有優先考慮問題染色體的畸變。因為DNA拷貝數變化是癌癥發病的重要病因，CGH大多應用于癌癥研究，然而CGH的潛力不局限于此。在臨床遺傳學，CGH也成為常規細胞遺傳學診斷不平衡染色體重排的輔助手段，并且應用越來越多［15］。CGH所需的DNA通常來自于一個已知的正常個體和一個未知染色體核型或已知異常染色體核型但需要進一步確診的個體。這2種DNA樣本分別標記2種不同的熒光素，它們同時與一個來自正常核型個體的中期核染色體雜交，在染色體一定位置熒光強度的不同顯示了基因組中片段的重復或丟失。CGH與M-FISH相比的優勢是它不只找出未知染色體的來源，還能繪制出來源染色體的特定區帶。M-FISH或SKY也可以識別標記染色體，它們對染色體畸變得診斷極有價值，但安裝和維護附帶設備需要耗費大量的財力和物力。因此，CGH最大優點是它只需要從患者和一個正常對照提取所需的DNA，用于全基因組范圍篩查的一次雜交，而不是用于雜交的一整組24條染色體涂染探針。此技術與傳統的細胞遺傳學有相同的局限性，主要是由于分析的基底是中期核細胞。因此，如同傳統的細胞遺傳學技術，CGH檢測的分辨率不高，分辨率是5～10 Mb［16，17］。

4 array CGH

微陣列基因組雜交（array comparative genomic hybridization，aCGH）是一種高分辨率、檢測全基因組范圍染色體特定拷貝數不平衡改變的方法。它的原理與CGH技術相似，但其最大的特點是將基因芯片替代了中期核染色體。以前的CGH技術受阻于中期核染色體上，并且最大分辨率為5～0 Mb，而array CGH技術的分辨率只受插入克隆的片段大小和其之間的距離限制。微陣列能使用各種大小的目標片段，從寡核苷酸 （25～85 bp）［18，19］到細菌人工染色體（BAC，80～200kb）［20］。array CGH 能夠檢測到基因組內任何DNA劑量不平衡改變，包括非整倍體、微小缺失和復制。array CGH能把成百上千個分散的位點整合在一張可以同時分析的微陣列上，它明顯優于常規的細胞核型分析和FISH技術。大多數的臨床可用的aCGH芯片都是靶向微陣列芯片，即經過設計用來特異性檢測非整倍體，已知的微缺失或是微復制綜合征和亞端粒或是其他非平衡性染色體重排。

現在已經普遍認為靶向微陣列芯片有顯著的優勢，因為它覆蓋了已知有臨床意義的染色體特定區域。一個好的靶向芯片應在檢測有臨床意義染色體非平衡改變有最高的敏感性，同時盡量減少發現需要FISH等試驗驗證的拷貝數變異（copy number variants，CNVs）。雖然現在的診斷方法還在不斷更新，但是可以預計微陣列芯片將成為確定染色體異常首要的診斷方法，因為它對于懷疑有細胞遺傳學上不平衡改變的患者有非常高的染色體異常檢出率［21］。與此同時aCGH也更容易檢出鑲嵌體，因為DNA將從送來的外周血或組織樣本提出，不會存在培養可能導致的突變［22］。

目前的研究顯示基因組中拷貝數的復制或丟失數量巨大并且十分常見。這些CNVs中的一部分被認為是無臨床意義的，因為在表型正常和異常的個體中它們平均分布。而剩下的則被認為是有意義的，尤其在異常表型的個體中發現了一個新的改變，但只有發現更多有相同改變的病例并且有確定的特點，才能確定它們之間的關聯。基于基因組微陣列的高分辨率，越來越多的CNVs將被發現，但是在診斷的模式中，這可能導致問題，因為不易分辨這些CNVs是單純多態性還是致病性的［23］。相對于全基因組aCGH，靶向微陣列芯片僅僅應用了已知染色體重排區域的克隆。這類芯片更常用于出生缺陷、精神發育遲緩或智能發育障礙、疑為染色體異常患兒臨床診斷［22，23］。因而在我們更清楚地認識人類基因組CNVs前，在臨床產前診斷中應用產前診斷靶向微陣列芯片是更可取的。

aCGH也有其技術的限制性。aCGH不能發現平衡性染色體改變，如易位和倒位等。這項技術是只能夠檢測同一個樣本中相對于其他DNA區域拷貝數的不平衡改變，所以aCGH無法檢測多倍體。此外，覆蓋整個基因組的高分辨率芯片更加昂貴，更有可能檢測到不清楚臨床意義的基因組非平衡改變。預算有限的小實驗室不能承擔微陣列實驗中需要用到的許多儀器（如：雜交儀，自動圖像分析）費用。此外，采購插入克隆掃描的FISH映射也非常昂貴。然而，這些障礙并不能阻擋其應用。aCGH能提供其他分子細胞遺傳學技術所不能達到的全面檢測染色體畸變的分辨率，可以預期aCGH會在不久的將來成為常規分子細胞遺傳學技術。

5 展望

分子細胞遺傳學技術的發展給胎兒染色體異常檢測提供了更多的方法。aCGH能提供前所未有的分辨率，但它同時也引起了有關解釋和區分病理和良性拷貝數改變的爭議。如同認識普通人群的倒位或是近端著絲粒斷臂的變異一樣，更深入了解人類基因組時，CNVs的困擾也將會消失。在產前診斷的應用中，新技術可能會檢測到一些額外的信息，如成人患的疾病，這是今后醫學倫理學需要探討的問題。毫無疑問，這些新的技術將大大有助于發現胎兒畸形和死亡的染色體病因，花費時間更少并且有更高的分辨率。然而，在這些新技術成熟發展成為某種形式的標準常規之前，它們還只能被認為是傳統核型分析的輔助方法。

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