PCR技術在產前診斷常見非整倍體疾病中的臨床應用

董小歡 賀靜 綜述 朱寶生 審校

（昆明醫學院附屬昆華醫院，云南省第一人民醫院遺傳診斷中心，云南 昆明 650032）

非整倍體疾病是一類因染色體數量異常引起的綜合征，目前尚無有效的治療方法。非整倍體疾病以三體型和單體型常見，95%以上的三體綜合征在出生前流產［1］。活產兒中最常見的三體綜合征包括21-三體綜合征（Down Syndrome）、18-三體綜合征（Edwards Syndrome）、13-三 體 綜 合 征 （Patau Syndrome）、Klinefilter綜合征，單體綜合征以Turner綜合征最為常見。常染色體單體綜合征幾乎不能存活到足月分娩。存活的非整倍體疾病患者表現出不同程度的智力低下、身材矮小、特殊面容、性發育不良以及其他各種組織器官的畸形等，生活難以自理，給患者、家庭和社會帶來了沉重的負擔。這些疾病目前尚無有效的治療方法，僅能通過產前篩查和（或）產前診斷后通過選擇性人工流產措施避免此類患兒的出生。

染色體核型分析是診斷非整倍體疾病的金標準，它能提供準確、豐富的信息量［2］。然而該技術耗時長，對人員的操作技術要求高［3］。熒光原位雜交（fluorescence in-situ hybridization，FISH）技術雖無需進行細胞培養，但染色體特異性探針的成本較高，每批次能檢測標本的規模較小，而且勞動力密集［2］。聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術自20世紀80年代中期問世以來，憑借快速、簡便、靈敏等優勢而被廣泛應用，隨著分子生物學技術的發展，近年PCR技術在非整倍體疾病快速診斷應用中發展迅速，比較傳統的細胞培養而言，PCR技術具有試劑成本相對較低、檢測批量大和快速的優勢。本文分別從定性、半定量、定量不同層次，探討PCR及相關技術在常見非整倍體疾病的產前診斷中的應用。

1 定性PCR

1.1 STR-PCR技術 短串聯重復序列（Short Tandem Repeat，STR）即微衛星位點，廣泛存在于人類基因組，以2～6個堿基為單位串聯重復排列。STR一般遵循孟德爾共顯性遺傳規律，具有雜合度高、多態信息量大的特點，因此可作為一種遺傳標記，用于染色體病、單基因病等多種遺傳病的產前診斷。其產生機制是復制滑脫或者DNA互補鏈堿基錯配導致重復單位的插入［4］。1991年，Edwards等［5］建立了STR-PCR分型技術。該法選用染色體上的STR位點進行PCR擴增后進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后銀染顯帶分型，根據條帶的數目及濃度判斷是否為三體綜合征。

朱金玲等［6］選擇21號染色體上的4個STR位點（D21S2055、D21S1244、D21S1435、D21S1809）用該法檢出了所有由核型分析確診的單純型21-三體，并可判定額外染色體的親代來源。王歡等［7］選擇21號染色體關鍵區域內部及附近的6個STR位點 （D21S11、D21S1412、D21S1437、D21S1413、D21S1446、D21S1270），采用該技術快速產前診斷5例單純型21-三體綜合征。自2007年1月到2009年12月，本院常規選用5個STR位點（D21S11、D21S1437、D21S1411、D18S535、D18S1002），對1 968名孕婦進行了快速產前診斷，共診斷19例唐氏綜合征、10例18-三體綜合征，其結果與染色體核型分析基本一致。

STR-PCR技術具有簡單、安全、成本低的優點［8］。PCR反應需選用具有高度多態性的STR位點，當胎兒在某位點上為純合子時則無法提供診斷依據。本院診斷的1 968例標本中出現了1例特殊樣本，在5個常規STR位點上均表現為純合子，因此無法明確診斷。應用該方法，同時結合親代的基因型可以判斷子代額外染色體的來源，還可判斷染色體不分離發生的時間［9］。當三體綜合征的實驗結果表現為濃度1：1：1的3條帶時，提示減數分裂I期同源染色體不分離；表現為濃度1：2的2條帶時，提示減數分裂II期姐妹染色單體不分離。

此外，本方法可以鑒別標本中是否存在母血污染，但對于易位型或嵌合型的染色體三體可能漏診。該方法在實驗結果的判斷上易受主觀因素的干擾從而影響其準確性，因此該方法終會被定量PCR所取代，以降低漏診率和假陰性。

1.2 甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP） MSP法的原理是基于DNA經亞硫酸氫鈉處理后，所有未甲基化的胞嘧啶發生脫氨基變為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶無此改變。基于這種堿基的改變，分別設計2對針對甲基化與非甲基化等位基因的引物，PCR擴增后聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產物就可以將甲基化與非甲基化等位基因區分開。

Sergio等［10］利用X染色體上FMR-1基因來進行X染色體的倍性分析，并設計了2對引物進行檢測。用亞硫酸氫鈉處理DNA樣品后甲基化的X染色體上CpG島的胞嘧啶并未發生改變，這樣其中一對引物的PCR產物為142 bp的片段；另一對引物針對處理后未甲基化的Cp G島合成84 bp的產物。在整個基因組中，Cp G島通常位于基因的啟動子區域，在正常情況下，Cp G島是以非甲基化形式存在于基因的啟動子內。但有兩個例外，其中1個是在已失活的X染色體上的基因，如女性的1條X染色體。在這種情況下，其啟動子區域的Cp G島是甲基化的，而且這種甲基化是與該基因的轉錄抑制有關。應用該法，正常女性可見142 bp和84 bp的2個片段，而特納綜合征的女性僅見84 bp的片段，同時利用15號染色體上SNRPN基因的Cp G島作為內對照。在研究中，作者對1例特納綜合征的胎兒進行了產前診斷，并對20例已確診的特納綜合征患者及42例正常女性對照進行X染色體的倍性分析。研究結果顯示該種診斷方法靈敏度高，準確率達100%，而且該方法簡單易行、快速高效（整個實驗可以在48小時以內完成）、準確、并無需使用昂貴的設備。該方法的建立為進行X染色體的倍性分析提供了一條簡單易行的途徑，但是該方法是利用X染色體的失活來進行檢測的，所以只能用于進行X染色體的倍性分析。

1.3 多連接依賴性探針擴增（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA） MLPA是一種高通量、針對待測核酸中靶序列進行定量分析的技術，基本原理包括探針和靶序列DNA進行雜交，之后通過特異化連接，PCR擴增連接完好的探針，產物通過毛細管電泳分離及數據收集，相關軟件對收集的數據進行分析，得出產物峰的峰面積、峰高度，根據特定基因拷貝數的改變，即可確定染色體數目的異常。

Dan等［11］對517例自然流產胎兒進行染色體核型分析，發現其中7例表現為2條染色體三體，對這7例樣本進行MLPA，準確的診斷了這7例樣本的核型。范新萍等［12］采用該技術檢測34份標本13、18、21、X和Y染色體拷貝數的變化，其結果除一份提示母血污染外，其余33份外周血、臍帶血或羊水標本報告均與染色體核型分析結果一致，臨床符合率97.1%。

MLPA是一種敏感性高、準確性高、快速經濟的診斷方法，但不能應用于檢測被污染的羊水標本，亦不能用于檢測STR位點及染色體的平衡易位。

2 半定量PCR

2.1 引物原位標記（primed in situ labeling，PRINS） PRINS是由細胞遺傳學、分子生物學以及免疫學技術相結合形成的一種新技術，該技術將FISH與PCR結合起來，其基本原理是應用寡核苷酸引物與變性后的染色體DNA特異結合，然后用非同位素標記的脫氧核苷酸（d UTP）參與延伸反應，標記了的d UTP將以堿基配對的形式摻入新合成的DNA單鏈中，最后用相應的熒光抗體與標記物結合，在熒光顯微鏡下觀察熒光信號。

Kirsten等［13］用該技術成功地對262例未培養的羊水標本進行檢測，診斷其中的2例18三體，無假陽性及假陰性結果。劉楊等［14］采用該技術對10例典型三體型唐氏綜合征患者進行基因診斷，結果均顯示3個明顯的標記信號。

與FISH相比，該方法更快速、簡便（僅需1～2小時，前者常需過夜）、價格低廉（費用為FISH的1／10），可鑒別13與21號染色體（FISH由于采用著絲粒探針，13與21號染色體存在高度同源性故常發生交叉反應而影響實驗結果），多色PRINS反應中每一個引物與靶序列的退火反應都在各自的最適溫度下進行，從而保證了其特異性［15］。

2.2 同源基因定量PCR（HGQ-PCR） HGQ-PC法設計一對公用引物，同時擴增一對同源基因，產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，經掃描后用軟件分析，檢測這兩個同源基因的PCR擴增產物的相對比值并統計分析其變異范圍，可以檢測出非整倍體中增加的染色體的基因拷貝。

王謙等［16］針對178名正常人和38名唐氏綜合征患者，用該法同時擴增21號染色體唐氏綜合征致病關鍵區域的人肝型磷酸果糖激酶基因（PFKLCH21）和位于1號染色體的人肌型磷酸果糖激酶基因（PFKM-CH1），2組研究對象的同源基因比值差異有統計學意義。

該方法需要使用光密度掃描儀，快捷、較QFPCR法費用低廉。除PCR循環周期外，DNA質量是影響PCR擴增的主要因素。如果DNA質量太差，將僅能擴增出較小的PFKL基因片段，而較大的PFKM基因片段擴增失敗［17］。

3 定量PCR

3.1 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR） 實時熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。而在非整倍體的診斷中多采用比較閾值法實現定量測定而無需制作標準曲線，即在同一個反應體系中同時擴增目的基因和管家基因，反應結束后分別獲得兩基因的CT值，根據數學方法推導得出目的基因相對于管家基因的量。

高斌等［18］選擇21號染色體上唐氏綜合征特異區域基因片段（DSCR3）為目的基因，以12號染色體上的GAPDH為參照基因，設計引物以及分別以不同熒光標記的Taq Man探針，在同一個反應管中進行擴增。檢測20例經細胞遺傳學分析確診為三體型的唐氏綜合征患者血標本和30例正常血標本，分別獲得患者和正常人的ΔCT值，兩組數據間有非常明顯的差異，且無交叉重疊。余蓉等［19］應用該技術擴增12號染色體上GAPDH基因、21號染色體上S100B基因和DSCR1基因，比較得病例組與對照組ΔCT值有統計學意義，且病例組低于對照組。Jerome等［20］同時擴增非多態性目的基因DSCR1和內參基因CFTR（囊性纖維化跨膜調節蛋白），然后計算兩基因的比值，在154例羊水標本中共檢測出2例21-三體，所有標本的檢測結果均與核型分析一致。Tomoko等［21］同時擴增目的基因鉀離子電壓門控通道基因（21q22.12）和內參基因核糖體磷蛋白基因（18q21.1），然后計算2基因的ΔCT值，唐氏綜合征的ΔCT值明顯高于正常對照組，且兩者間無重疊。

比較閾值法多選用非多態性的遺傳標記（不同于QF-PCR中常用的STR位點），因此不必尋找基因上的多態片段，只需要一對探針標記的引物即可；但與此同時又帶來一個缺陷，那無法鑒別標本中的母血污染。此外，該法簡單（設置管家基因作為內參照，省去了制作標準曲線的復雜過程，滿足了對原始模板的定量需要）、成本低、通量大，但需優化條件使目的基因和參照基因的擴增效率一致［22］。該法可以診斷三體型和易位型患者，但是對平衡易位患者（因為基因總量不變）、嵌合型患者難以明確診斷，需要進一步研究、完善。

3.2 定量熒光PCR（Quantitative Fluorescence PCR，QF-PCR） QF-PCR法通過熒光標記的引物，PCR擴增DNA樣本，經毛細管電泳分離擴增產物。根據內標（相當于DNA marker）的指示，軟件自動計算出檢測片段的信息（出峰時間、片段大小、峰高、峰面積及根據橫坐標的出峰位置），并通過點擊每個檢測峰而顯示。由片段大小可判斷出該峰所指示的是何種引物擴增出的標記物。根據峰個數、峰高、峰面積值就可判斷出該標記物指示的染色體數目。多選用雜合度、特異性高的STR位點作為遺傳標記。若為雜合子，顯示為2個峰，定量之比為1：1；若為純合子，顯示為1個峰，其定量值為正常對照的2倍。

江帆等［23］針對21號染色體上特異的3個STR位點（D21S1435、D21S1411、D21S11），X 染色體上的兩個STR位點（DXS981、DXS6809），X、Y 染色體上共有的STR位點X22及性別特異性位點AMXY設計引物，引物的5端標記熒光，對202份外周血標本提取基因組DNA進行七重定量熒光PCR擴增，使用ABI310測序儀進行PCR結果分析，根據國際統一判斷標準進行結果判斷，與染色體核型診斷結果具有同一性。Celia等［24］對2000年6月至2004年3月英國泰姆地區接受遺傳服務的8 983例標本進行了QF-PCR，共檢測出18例嵌合體，含3例13-三體、7例18-三體、7例21-三體、1例嵌合三體。他們同時還發現聯用核型分析和QFPCR比單用其中任一方法能檢測出更多的嵌合體。

QF-PCR法常選用高度多態性的STR位點作為遺傳標記，當胎兒在某位點上為純合子時，實驗結果無法提供診斷信息，此時就應增加位點數以滿足診斷需要。Levett等［25］開展的一項含有5 000份羊水標本的前瞻性研究發現，約2%的標本在某一個染色體上有7～8個位點均表現為純合子，因此無法明確診斷。此外，該方法診斷染色體異常疾病的靈敏度高、特異性強，可以分析出異常染色體的雙親來源，判斷異常染色體是來源于減數分裂1期還是減數分裂2期［26］。羊水中常見的少量母血污染并不影響QF-PCR，而大量的母血污染可能掩蓋胎兒的基因型。Celia等［24］認為當異常細胞株的比例不小于15%時，QF-PCR才能檢測出嵌合體的存在。

3.3 數字PCR（digital-PCR） 數字PCR將DNA樣本稀釋后分裝到芯片的每個孔中，其平均含量少于一個拷貝。數字PCR通過計數從單個模板分子擴增而來的DNA量實現精確定量測定，反應后產生陽性信號的孔數與原始樣本中的DNA模板分子數相關。

Christina等［2］從正常細胞株和21三體細胞株中提取人類基因組DNA，隨后分別以不同比例混合2個基因組，針對21號染色體上的淀粉樣蛋白基因以及12號染色體上的磷酸甘油醛脫氫酶基因設計特異性引物和Taqman探針，適當稀釋后的DNA模板加載于微流控芯片，在熒光成像熱循環系統上進行40個循環的兩步法PCR。反應結束后計數陽性信號的孔數，可得出在正常人中2基因的比值為1∶1，21-三體病例中2個基因的比值為3∶2。

該法不具有其他分子技術的局限性，比定量PCR的精確度更高，受擴增效率波動的影響較小，不依賴于等位基因的分布，即使是嵌合體和母血污染的DNA都可以檢測到信號［2］，可用于檢測任何一種非整倍體疾病。

4 小結

綜上所述，各種基于PCR的定性、半定量、定量技術廣泛應用于常見非整倍體疾病的快速診斷，每種方法都各有利弊。目前，國內的文獻中涉及的診斷方法多采用STR-PCR法、QF-PCR等，國外開始有應用數字PCR的文獻報道，但仍以QF-PCR的應用更為普遍。數字PCR能夠提供更多的診斷信息，結果的可靠性將會更高，成本也更高一些，值得進一步的應用研究。

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