外源性熱休克蛋白70基因對心肌細胞損傷的保護作用

劉季春 萬 力 何 明

(1.南昌大學第一附屬醫院心臟外科,江西南昌 330006;2.南昌大學醫學院藥學系,江西南昌 330006)

熱休克蛋白(heat shock protein,HSPs)對心肌細胞損傷的保護作用引起國內外心血管界的極大興趣與高度關注[1]。動物經熱處理后其離體、在體心臟或經熱處理后的心肌細胞均可誘導HSP70的生成,并可明顯改善缺血/再灌注損傷后左室收縮功能與心肌酶譜、縮小梗死面積、減輕心肌細胞超微結構損傷。進一步研究提示:上述保護作用與 HSP70 mRNA和蛋白質的表達量成正比[2],HSP70作為一種內源性心肌保護物質,在心肌缺血預適應的延遲保護作用中發揮重要作用[3]。本研究以脂質體為基因轉導載體,將高表達的pCDNA HSP70質粒導入大鼠心肌細胞,比較所表達的HSP70對心肌細胞急性實驗性缺氧/復氧(A/R)損傷的保護作用及其與熱休克心肌細胞保護模型之間作用的異同,并對其機制進行探討。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 SD新生大鼠(1～3 d),雌雄不拘,由江西醫學院醫學實驗動物科學部提供。

1.2 大鼠心肌細胞的原代培養 參照Spector等[4]方法略加改進,下列操作均在超凈工作臺內進行。取30只出生1～3 d內SD大鼠,消毒后開胸取出心臟,立即放入預冷的D-Hank液中,剪開心臟沖洗3次,取心室肌并剪成1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊,加入無鈣、鎂 0.1%胰蛋白酶溶液 10 mL,36℃磁力攪拌8 min,吸取上層混懸液丟棄;再加入無鈣、鎂0.1%胰蛋白酶溶液10 mL于組織中消化8 min,再次移棄上清液;向組織中續加10 mL胰蛋白酶液消化,吸取消化后的上清液,加含15%FBS的MEM培養基10 mL,在溫度10℃環境中離心6 min,轉速1 000 r?min-1,再向組織加入0.1%胰蛋白酶溶液10 mL消化,反復多次,直到組織碎塊消化,細胞分離完畢。所收集的細胞用含15%胎牛血清的MEM培養基混懸后,置CO2培養箱(5%CO2、95%空氣,37℃)培養 2 h,用差速貼壁法去除成纖維細胞,將懸浮的心肌細胞過200目不銹鋼網,計算細胞懸液中臺盼藍復染的活細胞數達90%以上。用培養液調整細胞濃度為5×105個?mL-1,之后分別按5×105個/孔和105個/孔接種于24孔培養板或96孔培養板內,于37℃,5%CO2、95%空氣條件下培養,隔天換培養液,開始3 d加入0.1 mM Brd U抑制纖維細胞生長。培養第3天進行隨機分組實驗。

1.3 大鼠心肌細胞A/R損傷模型與HS保護模型的制作

1.3.1 心肌細胞A/R液制備 參照Koyama等[4]和Xu等[5]方法,取培養相應時間的心肌細胞,對培養的心肌細胞以缺氧、缺糖模擬缺血,以恢復氧和糖的供應作為再灌注。模擬缺血溶液(NaH2PO4 0.9 mM,NaHCO3 6.0 mmol?L-1,CaCl2 1.8 mmol? L-1,MgSO41.2 mmol? L-1,HEPES 20 mmol? L-1,NaCl 98.5 mmol?L-1,KCl 10.0 mmol?L-1,p H 6.8,37℃)預先用95%N2、5%CO2混和氣體飽和1 h;模擬再灌注溶液(NaCl 129.5 mmol?L-1,KCl 5.0 mmol? L-1,NaH2PO40.9 mmol? L-1,NaHCO3 20 mmol?L-1,CaCl2 1.8 mmol?L-1,MgSO4 1.2 mmol?L-1,葡萄糖 55 mmol?L-1,HEPES 20 mmol? L-1,p H 7.4,37℃)預先用95%O2、5%CO2混和氣體飽和1 h。用模擬缺血溶液置換正常培養溶液即缺血,用模擬再灌注溶液置換缺血溶液即為再灌注。

1.3.2 心肌細胞A/R損傷模型 實驗時,棄培養液,換模擬缺氧液,將培養板置于持續95%N2、5%CO2平衡的缺氧密閉容器中(37℃)3 h,再換上模擬再灌注液,以95%O2、5%CO2進行復氧孵育2 h(37℃)。

1.3.3 心肌細胞HS保護模型 實驗分組后,即刻將HS組心肌細胞置入42℃中培養1 h;轉入正常心肌細胞培養48 h,再進行A/R損傷實驗。

1.4 p CDNA HSP70質粒-脂質體復合物和轉導人p CDNA HSP70質粒由美國芝加哥大學王山鳴教授惠贈,經擴增和純化,與脂質體在室溫下混合10 min。按照操作說明書將該復合物與心肌細胞混合,完成心肌細胞轉導。

1.5 實驗分組 隨機分為4組,對照組、缺氧/復氧(A/R)組、熱休克處理后缺氧/復氧(A/R+HS)組和p CDNA HSP70質粒轉導后缺氧/復氧(A/R+pCDNA HSP70)組。每次實驗復孔,重復4次。處理時間按圖1進行。

1.6 細胞存活率 采用MTT比色法[6]檢測。心肌細胞培養于96孔培養板,接種密度為105個/孔,每孔液體200μL。去培養液,復氧2 h后各組每孔加入MTT溶液(5 mg?mL-1)20μL,孵育4 h,每孔加入150μL DMSO,振蕩10 min,選擇490 nm 波長,在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值。設不加細胞只加孵育液的空白對照,記錄結果。細胞存活率=(實驗組光吸收值/對照組光吸收值)×100%。

1.7 生化檢測 實驗結束后各組分別取孵育液200μL,用美國 Beckman生化自動分析儀測定LDH活性。

1.8 透射電鏡觀察 實驗結束后,先用細胞刮刮下細胞,用4℃預冷的 PBS清洗,2.5%戊二醛、1%鋨酸常規固定、脫水、包埋、超薄切片、醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。用日本H-600型透射電鏡觀察、攝片。

1.9 大鼠心肌細胞HSP70 mRNA檢測(RT-PCR)

提取大鼠心肌細胞總RNA,經總RNA質量、濃度檢測與標化,建立逆轉錄反應體系。引物設計參照文獻[7];β-actin作為對照。HSP70引物:sense(5-AAC-GTG-CTG-CGG-ATC-ATC-AA-3);antisense(5-CTG-GAT-GGA-CGT-GTA-GAA-GT-3);產物長度為 347 bp。β-actin引物:sense(5-TCA-TCA-CCA-TTG-GCA-ATC-AG-3);antisense(5-GTC-TTG-GCG-TAC-AGG-3);產物長度為154 bp。PCR反應條件如下:熱啟動:94℃2 min;變性:94℃45 min;退火:55℃45 min;延伸:72℃1 min;經30個循環后,72℃3 min結束。取擴增產物15μL上樣,1.5%瓊脂糖凝膠電泳。定量計算方法為:所得HSP70產物帶與β-actin產物帶的綜合密度之比,再除以對照組相對應樣本的此兩條帶綜合密度之比。

1.10 大鼠心肌細胞 HSP70蛋白檢測(Western blot) 用預冷PBS洗心肌細胞3遍。加預冷溶解緩沖液,6孔板:200μL/孔;60 mm培養皿:500 μL/板。4℃孵育60 min。用細胞刮棒把細胞碎片連同細胞裂解液集中于一側,并轉移至預冷的Eppendorff管中。離心(12 000 g,4℃)10 min。取上清液,行心肌細胞總蛋白濃度的測定(Folin酚法)與標化。取含同等蛋白量的樣本稀釋至等體積,和5×蛋白上樣緩沖液按4∶1體積混勻,100℃水浴5 min,趁熱加樣,每孔道10μL,加樣后凝膠放置于裝有電泳緩沖液的電泳槽進行電泳。隨后于轉移液中平衡10 min,120 mA×60 min轉膜。轉膜后,將NC膜置TTBS漂洗液中,進行考馬斯亮藍法膠染。依次結合一抗和羊抗大鼠IgG-HRP二抗,顯影,曝光。將膠片掃描后,在醫學圖形分析系統上進行分析。計算方法為所得HSP70蛋白帶的綜合密度除以Control組相對應樣本的綜合密度。

1.11 心肌細胞內Ca2+的檢測[8]實驗結束后,棄去相應的處理液,加入負載指示劑(Fluo-3的終濃度為2μM)避光37℃孵育30 min后用分離緩沖液(detach buffer)沖洗,并在分離緩沖液中孵育10 min。低速離心(1 000 g)收集洗脫的細胞,棄去上清液,并用測定緩沖液(assy buffer)重新懸浮細胞,于流式細胞儀上檢測,激發波長為488 nm,隨機測定單個心肌細胞的熒光強度值,取10萬個心肌細胞的熒光強度值的平均值為每份標本的測定值。

1.12 數據處理 定量資料以均數土標準差(ˉx±s)表示,采用統計軟件SPSS11.5進行方差齊性檢驗、單因素方差分析,組間比較用LSD法;定性資料用卡方檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞存活率 對照組大鼠心肌細胞存活率分別為86.2±10.9;HS+A/R組與pCDNA HSP70+A/R組存活率分別為 73.1±12.2、77.6±12.5,較A/R組顯著增加(33.8±7.3,P＜0.01),表明熱休克和pCDNA HSP70質粒轉導可對抗A/R損傷所致細胞存活率的下降。

2.2 各組心肌細胞培養液中 LDH活性 對照組大鼠心肌細胞培養液中LDH活性為2.3±0.4,HS+A/R組與pCDNA HSP70+A/R組培養液中LDH 活性分別為 12.1±2.7、10.9±2.3,較 A/R組(20.6±3.4)明顯降低(P＜0.01),表明熱休克和pCDNA HSP70質粒轉導可對抗A/R損傷所致細胞培養液中LDH活性升高。

2.3 各組心肌細胞超微結構改變 電鏡下,A/R組心肌細胞肌原纖維排列尚整齊,肌漿網明顯擴張呈空泡狀,線粒體腫脹、結構破壞,嵴紊亂、稀疏;HS+A/R組、pCDNA HSP70+A/R組心肌細胞肌原纖維排列整齊、橫紋清晰,線粒體結構基本正常,表明熱休克與pCDNA HSP70質粒轉導均可有效地對抗大鼠心肌細胞A/R所致的細胞超微結構的改變。

2.4 各組心肌細胞HSP70mRNA表達 在對照組心肌細胞未見有HSP70 mRNA的表達。A/R組心肌細胞可見有少量的HSP70mRNA表達,而HS+A/R組、pCDNA HSP70+A/R組心肌細胞表達顯著增加,分別是A/R組的1.82±0.26倍和2.05±0.33倍(P＜0.01),兩者間也有顯著差異(P＜0.01),表明心肌細胞的熱休克保護模型及pCDNA HSP70質粒轉導均已成功,且后者增加HSP70 mRNA作用更強。

2.5 各組心肌細胞HSP70蛋白表達 對照組心肌細胞未見有HSP70蛋白表達。A/R組心肌細胞可見有少量 HSP70蛋白表達,而 HS+A/R組、pCDNA HSP70+A/R組心肌細胞表達顯著增加,分別是A/R組的2.33±0.31倍和3.26±0.42倍(P＜0.01),兩者間也有顯著差異(P＜0.01),表明心肌細胞熱休克保護模型及pCDNA HSP70質粒轉導均已成功,且后者增加HSP70的表達作用更強。

2.6 各組心肌細胞內Ca2+的改變 扣除背景的熒光量后,對照組心肌細胞內Ca2+為11.84±1.37,A/R組為 23.21±2.81,明顯高于對照組(P＜0.01);而 HS 組、pCDNA HSP70組分別為 15.56±1.62、14.24±1.65,明顯低于 A/R 組(P＜0.01),表明熱休克和pCDNA HSP70質粒轉導可對抗大鼠心肌細胞A/R損傷所致的細胞內Ca2+升高。

3 討 論

研究表明,許多應激原(包括熱休克、缺血、壓力和容量負荷、藥物)都能誘導心肌表達HSP70。更有實際意義的是通過熱處理增加細胞熱耐受力的同時,也增加了對其他應激原的耐受,反之亦然,即交叉保護現象[9]。因此如何迅速誘導HSP70高水平表達具有臨床意義。目前,提高心肌細胞HSP70含量的方法有兩類:誘導內源性HSP70表達和導入外源性HSP70基因。熱休克預處理與缺血預處理是誘導內源性HSP70表達的經典方法。但這兩種方式因其固有的創傷性及保護作用的時間局限性,且無法預測心血管疾病的發生和預處理的難控制性,不能作為一種臨床療法進行治療。

用某些藥物進行干預、誘導,即藥理性缺血預適應保護,確實可有效誘導HSP70蛋白在心肌細胞中表達,產生心肌保護作用。實驗證明,中藥有效成分阿魏酸鈉[10],可誘導HSP70蛋白表達,對大鼠急性心肌細胞損傷產生藥理性缺血預適應保護。

近年研究提示,利用分子生物學技術,將外源性HSP70基因導入心肌細胞中以提高HSP70基因的表達水平,也可保護心肌免遭急性損傷。基因療法是隨著分子生物學進展而出現的一種全新治療方法。任何基因療法需采用安全、方便、無毒的措施將目的基因傳遞至靶細胞或靶器官。向細胞內轉移目的基因的方法可分為兩大類:病毒載體途徑和非病毒載體途徑。但以病毒為載體的轉基因技術不但安全性問題尚未完全解決,而且無法估計插入宿主細胞內基因長期穩定表達所引起的遠期生物效應之利弊[11],使其臨床應用受到極大的限制。

在本研究中,我們將pCDNA HSP70轉導入大鼠乳鼠原代培養的心肌細胞內,經48 h孵育,成功誘導出HSP70mRNA及其蛋白的高表達,其與同步進行的熱處理誘導出的HSP70蛋白一樣,表現出強大的抗急性A/R損傷作用。使在遭受急性A/R損傷后,心肌細胞存活率大幅度提高,細胞培養液中LDH、CPK等心肌損傷標記物活性明顯降低,細胞超微結構基本接近正常;利用pCDNA HSP70質粒轉染獲得的心肌保護效果與熱休克預處理無明顯差異,表明外源HSP70基因表達可起到保護作用,反之也證明HSP70是熱休克預處理中起主要作用的因子。

心肌缺血再灌注損傷的主要病理生理學改變之一是心肌細胞內的游離鈣含量急劇增加,出現鈣超載。本研究證實:急性 A/R處理使心肌細胞內Ca2+含量明顯增加;熱休克處理可抑制這種增加;pCDNA HSP70質粒轉導所引起HSP70蛋白高表達,在使心肌細胞急性A/R損傷明顯減輕的同時,也可對抗這種增加;提示HSP70蛋白對抗急性心肌細胞損傷的作用至少部分與對抗細胞內Ca2+含量的增加、防止心肌細胞內鈣超載有關。

綜上所述,HSP70蛋白作為生物體內廣泛存在的一種應激蛋白,可快速、短暫調整應激過程中細胞的存活機能,保護細胞免遭損傷,并有助于細胞恢復正常的結構和機能。在急性心肌損傷過程中不論用何種方法誘導出的HSP70蛋白,均可有效地對抗大鼠急性心肌損傷。其抗損傷機制與對抗細胞內Ca2+含量的增加、防止心肌細胞內鈣超載有關。

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