Der f2重組蛋白用于變應性鼻炎患者血清ELISA檢測

徐 楓 王建中 張利能

(1.復旦大學附屬中山醫院耳鼻喉科,上海 200032;2.復旦大學上海醫學院生物化學和分子生物學系,上海 200032)

變應原檢查對變應性鼻炎診斷和治療有很重要的意義。現在有多種變應原檢查方法,體內檢查有皮內試驗、點刺試驗[1]、斑貼試驗和激發試驗[2]等;體外實驗包括嗜堿粒細胞組胺釋放實驗、放射變應原吸附實驗[3],UniCap[4]和酶免實驗[5]等。用酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)檢測IgE、IgG,可以達到半定量的要求,是一種比較經濟、簡便的檢測方法。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 粉塵螨過敏患者血清 26例變應性鼻炎患者接受常見變應原皮膚點刺試驗,其中粉塵螨點刺反應陽性患者24例,粉塵螨反應陰性患者2例。抽取5 mL靜脈血,分離血清,-80℃保存。Der f2特異性IgE陽性血清盤(panel)來自于美國PlasmaL-ab International和 Greer Laboratories,Inc.公司 。

1.1.2 臨床點刺試驗材料 粉塵螨變應原點刺液、點刺針為Allergopharma產品。

1.1.3 BCA蛋白質定量試劑盒 購自Pierce公司。

1.1.4 粉塵螨蛋白 原核表達純化的野生型Der f2。

1.1.5 ELISA試劑及材料 包被試劑:0.05 mol?L-1碳酸鹽緩沖液(pH 9.0)。洗滌液:1×PBS,加入Tween-20至0.02%濃度。封閉液:以洗滌液配制成含3%BSA的溶液。HRP標記的抗人IgE抗體、TMB底物溶液和2N H2 SO4終止液購自KPL公司。96孔酶標板購自Nunc公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Der f2原核表達及純化 依據粉塵螨變應原蛋白質第2組分序列設計引物。上下游引物序列分別加入 Eco R I和 Bam HⅠ位點,以利于與pBV220載體連接。以粉塵螨變應原蛋白質第2組分cDNA為模板,以PCR方法擴增編碼序列。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后,切取特異性PCR條帶所在的膠條,按照膠回收試劑盒提取PCR產物。將膠回收的PCR產物與 T載體連接。連接產物轉化DH5α感受態細胞,通過藍白斑篩選,挑取白色菌落搖菌,質粒小抽,以Eco RI+Bam H I雙酶切重組T載體,將Der f2 DNA片段與p BV220質粒連接。連接產物轉化DH 5α,轉化菌送檢測序。用重組質粒轉化BL21菌誘導表達。

工程菌母液按1%體積比接種于2×YT培養液中,培養至OD600=0.8,再誘導培養6 h。菌體沉淀重懸于50 mL細菌裂解液中;超聲破菌后,4℃12 000 r?min-1離心30 min,棄上清液。包涵體沉淀洗滌后,以變性液溶解包涵體沉淀。采用Amersham FPLC系統,在線對Der f2進行純化、復性。A280檢測收集蛋白峰,每管 1 mL。經 Tricine-SDS-PAGE銀染后觀察,合并Der f2蛋白峰。

1.2.2 皮膚點刺試驗 按照Allergopharma試劑盒說明書操作規范,在每例患者前臂點刺常見變應原,同時點刺組胺和0.9%氯化鈉溶液,分別作為陽性對照和陰性對照。點刺后20 min觀察反應,以皮丘直徑大于組胺點刺皮丘直徑判定為陽性。

1.2.3 ELISA包被 蛋白質以包被液稀釋成60 ng?mL-1的濃度,每孔加入100μL,4℃包被過夜。以洗滌液洗滌3次,每次5 min。封閉:每孔加300 μL封閉液,4℃封閉過夜。反應:每孔加入100μL血清或5倍稀釋的血清,37℃反應2 h。以洗滌液洗滌4次,每次5 min。HRP標記的抗抗體反應:每孔加入 100μL 1∶3 000稀釋的 HRP-anti-human IgE,37℃反應 2 h。以洗滌液洗滌4次,每次 5 min。底物呈色:每孔加入100μL底物液,37℃反應15 min后,加入100μL終止液。讀數:以570 nm和450 nm波長讀取OD 570-OD450值。

2 結 果

2.1 pBV220-wt Der f2重組質粒的構建 將wt Der f2和mu Der f2分別插入載體pBV220,構建成pBV220-wt Der f2和 pBV 220-mu Der f2重組質粒。以EcoR I和BamHⅠ酶切產生與Der f2基因大小一致的片段。過 DNA測序驗證,結果表明DNA序列與NCBI的序列一致。

2.2 粉塵螨Der f2重組蛋白的表達純化 wt Der f2蛋白在42℃誘導條件下形成了包涵體。菌體經超聲破碎后,充分洗滌包涵體以除去可溶性蛋白以及膜蛋白。將包涵體溶于變性液中,進行Sephacryl S-100HR柱層析分離及復性,通過分子篩除去包涵體中的雜蛋白,同時w t Der f2蛋白通過填料介質的不斷吸附-解離而正確折疊,從而得到復性的wt Der f2蛋白(圖1)。

2.3 檢測方法的線性范圍和靈敏度 用PlasmaLab粉塵螨Derf2變應原特異性IgE標準血清(1.66 U?mL-1～100 U?mL-1),制作標準曲線(圖2)。對測得的OD值和Der f2特異性IgE濃度作回歸分析,回歸系數R2值為0.996。按照ELISA靈敏度計算方法[6],對0 U?mL-1標準液進行10次測試,求得零劑量點光密度均值(ˉx)和標準差(s),將ˉx+2s值插值運算,得到靈敏度值為0.73 U?mL-1。

2.4 臨床血清樣品的檢測 在26例變應性鼻炎患者中24例粉塵螨點刺反應呈現陽性,2例的點刺反應陰性。以野生型Der f2為包被材料的ELISA試劑盒,分析24例點刺反應陽性的患者血清中Der f2特異性IgE的濃度,按照國際sIgE分級標準分為陽性和陰性[4],結果22例陽性,陽性率為91.7%。

3 討 論

變應性鼻炎的實驗診斷包括體內和體外方法,但體內方法無法進行定量分析。在體外方法的變應原特異性IgE檢測試劑中,Pharmacia UniCap特異性IgE檢測系統具有較好的檢測效率。Pharmacia UniCap的優點是,采用結合大量變應原的高分子化合物固相,具有較高的靈敏度,特別是多種變應原共同偶聯于同一固相,對于變應原的篩查具有其它試劑所沒有的靈敏性。我們根據經典的間接ELISA原理設計的Der f2特異性IgE檢測試劑,可定量分析血清中Der f2特異性IgE,其靈敏度等指標與商業試劑具有平行性。已符合ng級分析要求,達到了國際sIgE分級中判斷陽性和陰性的截點標準。

由于ELISA微孔包被有足夠量純化的變應原蛋白質,因此在針對性檢查患者血清中某一特定變應原IgE時,ELISA同樣具有與Pharmacia UniCap相當的靈敏性。基于這種考慮,研究設計了Der f2特異性IgEELISA檢測試劑。事實上,ELISA方法具備相當高的測試效率,廣泛用于患者血清中抗原或抗體的分析。通過標記信號放大系統的改進,ELISA可以應用于皮克(pg,10-12g)級IgE定量分析。

目前,變應原篩查和定量分析試劑系統采用世界衛生組織國際IgE參考標準品(75/502),這有助于提高通過不同方法獲得的總IgE和特異性IgE結果的平行性,本研究檢測試劑也采用同樣的標準。由于不同試劑系統中固相包被的變應原蛋白質不同,常缺乏標準化。本研究檢測試劑中固相包被的變應原蛋白是純化的Der f2,重組表達的變應原蛋白質可以很好地解決固相包被的變應原蛋白質標準化問題,此點是對包括UniCap等試劑系統的一個改進。

本研究設計的sIgE ELISA實驗可為螨類變應原引起的持續性變應性鼻炎提供輔助診斷依據。若用HRP標記的抗IgG抗體代替本檢測試劑中H RP標記的抗IgE二抗,則sIgG ELISA可用于檢測螨類特異免疫治療過程中機體產生的特定亞型IgG的濃度。雖然已有人開始以變應原蛋白質微陣列技術來篩查患者敏感的變應原[7],但在常年性變應性鼻炎變應原比較固定的情況下,本研究設計的變應原特異性IgE ELISA方法依然有利于明確診斷,同時,可以進一步檢測特異性免疫治療效果。

1 徐慧珍,徐林根,姜 輝,等.變應原皮膚點剌試驗在變應性鼻炎中的臨床意義[J].中國臨床醫學,2004,11(3):435-436.

2 Kanthawatana S,Maturim W,Fooanan S,et al.Skin prick reaction and nasal provocation response in diagnosisof nasal allergy to the house dust mite[J].Ann Allergy Asthma Immunol,1997,79(5):427-430.

3 Price JA,Reiser J,Longbottom JL,et al.Inhalant allergy in asthmatic child ren:skin prick test,radioallergosorbent test and chemiluminescent assay compared with allergen levels in their mattress dusts[J].International archives of allergy and applied immunology,1989,88(1-2):183-184.

4 Ricci G,Capelli M,Miniero R,et al.A comparison of different allergometric tests,skin prick test,Pharmacia UniCAP and ADVIA Centaur,for diagnosis of allergic diseases in children[J].Allergy,2003,58(1):38-45.

5 徐 楓,王建中,黃鳳娥,等.間接ELISA法對常年性變應性鼻炎患者血清中屋塵螨變應原特異性IgE的分析[J].中國臨床醫學,2005,12(6):1086-1088.

6 Grodzinsky E,Ivarsson A,Juto P,et al.New automated immunoassay measuring immunoglobulin A antigliadin antibodies for prediction of celiac disease in childhood[J].Clin Diagn Lab Immunol,2001,8(3):564-570.

7 Kim TE,Park SW,Cho NY,et al.Quantitative measurement of serum allergen-specific IgE on p rotein chip[J].Experimental&molecular medicine,2002,34(2):152-158.