熒光素酶報告基因在干細胞體內示蹤研究中的應用

杜子婧 楊 湄 昝 濤 李青峰

熒光素酶報告基因在干細胞體內示蹤研究中的應用

杜子婧 楊 湄 昝 濤 李青峰

活體生物發光技術是一種新興的成像技術，是利用熒光素酶在活體內的可檢測性、可視性和持續表達性，以暗視野CCD[1]（Charge-coupled device，電荷偶聯設備）相機系統為基礎的一種成像技術，它能有效地對報告基因標記的實驗對象進行實時、原位的觀測，可在完整的體內環境中快速獲得時間、空間的信息。生物發光技術具有非侵入性，可以減少實驗動物的數量，減少動物個體差異對實驗數據的影響[2－3]。與其他活體成像技術，如磁共振成像（MRI）、計算機斷層掃描（CT）、正電子成像技術（PET）等相比，活體生物發光技術更加敏感、安全、直觀，且操作簡單，已被廣泛應用于生命科學、醫學、藥物開發等多領域的研究[4-6]。

1 生物發光成像概述

1.1 熒光素酶報告基因

熒光素酶的種類繁多，其中主要用于研究且廣泛使用的是螢火蟲熒光素酶（Fluc）[7]。該物質從北美螢火蟲體內分離獲得，是由550個氨基酸組成的蛋白質[8]，具有較低的的免疫原性[9]，可以在體內長期存在。底物熒光素（D-luciferin），約為280 D的小分子，脂溶性，可在全身分布，不受血腦屏障和胎盤屏障的限制[10－11]。在氧氣、Mg2+和ATP的存在下，熒光素酶可與其底物相互作用，發出波長峰值為562 nm的可見光，而在正常體溫37℃時，峰值轉移到612 nm[12]，超過600 nm的波長可以將體內血紅蛋白的吸收作用降到最低，使更多的光可以穿透組織和皮膚而被檢測到[13-14]。其他種類的熒光素酶也有不同的應用，來源于細菌的熒光素酶（Lux）用于原核表達系統[15]；海腎熒光素酶（Rluc），在體內的代謝速度較螢火蟲熒光素酶快，所發波長在460～540 nm，大部分的光被組織吸收，因此該酶主要用于對前者的對照試驗或雙標記實驗。目前，GFP-Luc、RFP-Luc、Luc-LacZ以及雙熒光素酶等融合報告基因被廣泛使用。

熒光素酶報告基因標記干細胞有兩種方法，一是應用含Luc轉基因動物的干細胞移植到正常實驗動物體內進行活體示蹤；二是應用基因轉染技術進行標記。利用病毒載體將熒光素酶報告基因整合到預期觀察細胞的染色體上，常用的病毒載體有慢病毒、逆轉錄酶病毒和腺病毒[16]。其中，慢病毒載體可以長時間穩定表達目的基因，是構建熒光素酶報告基因載體的最佳選擇；而用逆轉錄酶病毒構建的方法在較長時間的培養中發現表達熒光素酶內的能力下降[17]；腺病毒轉染不能將報告基因整合到細胞的染色體中，限制了示蹤干細胞在體內的存活和擴增[18]。

1.2 成像原理及特點

每一個熒光素酶反應后只產生一個光子，由于散射和吸收的影響，能到達體外且能被檢測到的光子量很少，肉眼無法觀察，因此需要一套裝置來檢測光子。該裝置主要由3部分組成：低溫成像CCD相機、成像暗箱及成像軟件。生物發光的特點是不需要激發光，避免了對體內正常細胞的損傷，有利于長期觀察各種生物行為；由于動物體自身不會發光，生物發光有極低的背景，檢測靈敏度很高，可檢測到102數量級的細胞；信號可以定量，從體表的信號水平直接得出發光的細胞數量；可動態觀察體內細胞代謝活性及其增殖、存活情況。生物發光成像（Bioluminescent imaging,BLI）輸出的為二維圖像，使用與定性分析和定量計算，但難以實現光源的準確定位[19]；生物發光斷層成像（Bioluminescent tomography，BLT）可獲得活體小動物體內發光光源的精確位置信息，彌補了BLI在精確定位上的不足。

2 熒光素酶生物發光成像在干細胞研究領域中的應用

生物發光成像廣泛用于細胞凋亡[20]、蛋白質間的相互作用[21]、免疫細胞的遷移[22]、癌癥及其藥物的研究[23-24]等多領域。最近幾年，這種技術開始被用于干細胞的研究中，可在活體內觀察干細胞的行為和生物學特性及其轉歸，可以準確得到活動物體內靶位置的干細胞在各個時間點的生存和分化情況，動態、全面地檢測靶細胞在體內的轉歸過程，加速了干細胞在腫瘤、組織工程等領域中的研究，為干細胞的示蹤提供了一個有效的手段。

2.1 胚胎干細胞

胚胎干細胞（ECs）是一種全能干細胞，具有自我更新和分化成各種類型細胞的能力。Feng等[18]觀察EC-TF（三重融合基因標記的胚胎干細胞fluc-mrfp-ttk）移植到裸鼠的心肌，用BLI和PET進行比較監測。BLI信號在1～4周內不斷增強，特別是在第2～3周，PET信號逐漸增高，與BLI結果呈相關性，直接表明了ECs在宿主心臟內的存活和增殖。Li等[25]利用雙報告基因（Fluc-eGFP）比較4周內hECs（人胚胎干細胞）與hESC-ECs（人胚胎干細胞來源的內皮細胞）在SCID小鼠體內的轉歸。BLI信號顯示在移植的第2天，hESC-ECs-FLuc-eGFP表現了較強的信號，在隨后的時間內逐漸減少，說明移植后的ESC-ECs細胞快速死亡；而hECs-FLuc-eGFP表現了不斷增強的信號，形態學檢測與BLI結果一致，說明ECs在體內快速擴增。BLI可用于縱向監測胚胎干細胞在實驗動物活體內的生存和增殖。

2.2 骨髓來源干細胞

2.2.1 造血干細胞

對造血干細胞的研究已有多年的歷史，常規的實驗需要犧牲大量的實驗動物來觀察不同時間點的造血干細胞在體內的轉歸，無法達到實時縱向監測移植物在活體內的動態遷移和歸巢的全過程，而活體示蹤的方法可以動態、長期的觀察造血干細胞。Cao等[26]用熒光素酶標記的造血干細胞移植到輻射處理的小鼠體內，早期在脾臟和骨髓中發現了不連續的點狀發光，而后點狀發光不斷擴大遍布全身。在該實驗中，BLI提供了一個有力的方法評價造血干細胞在體內的生物學行為，監測造血干細胞在活體內的遷移與分布的過程。

2.2.2 非造血干細胞

骨髓來源的干細胞具有多向分化潛能性，可以分化成骨、軟骨、成肌細胞、神經等[27-33]。Hara等[34]利用這一技術實時監測MSCs在體內的轉歸。在損傷部位，動脈注射途徑產生的信號比肌肉注射途徑高4～5倍，雖然動脈途徑移植的初期會有MSCs在肺部聚集的情況，但是在第2天基本消失。生物成像結果表明，動脈注射是MSCs移植的最佳途徑。Inoue等[35]利用轉基因技術，將Luc基因轉入Lewis大鼠中，從中提取MSCsLuc和BMCsLuc，分別將兩種細胞移植到人工真皮上，修補頭部全層皮膚缺損的糖尿病大鼠，通過BLI觀察到MSCs停留在損傷部位的時間長于BMCs，而這一現象與組織學顯示損傷部位的愈合和血管數量呈正相關。Laura等[36]分別將hUVECLucGFP(人內皮細胞)和hUVECLucGFP與hMSCs的混合物（4∶1）皮下注射到裸小鼠的腹側，觀察血管的形成過程。在細胞移植的第1天，含有hMSCs的熒光素酶活性明顯高于不含hMSCs，隨即光子信號減弱，而在14 d時信號逐漸增強，該過程可能與血管網絡建立和整合到血管床有關。在120 d的觀察中，含有hMSCs的信號穩定，高于不含hMSCs的信號，這一結果與形成功能性血管呈正相關。Koen等[37]利用活體示蹤比較Luc/GFP轉基因小鼠不同的干細胞在心肌梗塞中的作用。BLI的數據顯示，移植后的第2天，在移植區域有較強的信號，說明了MSCs、ASCs（Adipose stromal cells）心肌內移植成功，隨后信號明顯減弱，4～5周后與背景水平一致。利用BLI技術驗證了在心臟區域移植的細胞沒有長時間的生存能力，同時該實驗認為GFP可能引起免疫反應，從而影響了移植細胞在心臟區域的存活[38－39]。在該實驗中帶有熒光素酶基因的細胞對機體影響小，安全性較好，有利于長時間的觀察細胞生物學行為。Akimoto等[40]用Luc/GFP轉基因小鼠的骨髓來源細胞體外培養，移植到經過輻射處理的小鼠體內，利用LPS直接注射到海馬區域誘導炎癥，生理鹽水作為對照組。在整個實驗過程中FLI的信號強度無明顯強弱改變，相對于對照組無差異，而BLI實驗組的信號明顯高于對照組，且與免疫組化結果一致。說明BLI優于FLI，可用于檢測到更深部的信號，是一種更好的示蹤方法。

2.3 神經祖細胞、神經干細胞

神經干細胞具有遷移能力，可分化成神經細胞、神經膠質細胞、少突神經膠質細胞，同時也可作為細胞載體，傳送治療因子。Shah等[41]用Gil36-RL（GFP-RLuc）建立小鼠惡性膠質瘤模型，將NPC-FL-sTRAILs移植到對側腦實質，觀察NPC（神經祖細胞）在體內的遷移狀況和腫瘤的大小。BLI的結果提示，NPC跨過胼胝體移動到腫瘤部位，且膠質瘤區信號范圍明顯縮小。Sher等[42]利用生物發光成像技術觀察Olig2-NSCs（神經干細胞）移植到Cuprizone模型小鼠胼胝體內，2周內BLI信號迅速下降，50 d后Olig2-NSCs信號僅為開始時的10%，表明大部分的細胞死亡，僅有少量的細胞存活。這兩個實驗說明，BLI可以通過監測發光點的范圍、光強度而直觀地獲得標記的細胞在體內的生存、分布、遷移和增殖等生物學信息。

2.4 肌肉干細胞

在肌肉干細胞的研究方面，Sacco等[43]將表達熒光素酶的MuSC（肌肉干細胞）和肌肉細胞移植到清空內源性衛星細胞并且肌肉損傷的NOD/SCID小鼠體內。BLI結果表明，移植MuSC產生較強的信號，而移植肌肉細胞則幾乎檢測不到信號；組織學證實，MuSC能夠在體內增殖、分化、修復肌肉損傷。結果表明，BLI的信號強度與供者來源的肌細胞數量呈正相關，BLI是一種可以量化供體細胞，動態示蹤供體細胞在活體內增殖的理想工具。

總之，干細胞移植在骨缺損、腦血管疾病、神經系統疾病、血液病、缺血性疾病、肌肉損傷修復等方面[44-46]都有著廣闊的應用前景，建立一種干細胞活體示蹤方法對了解其體內生物學行為極其重要。生物發光成像所具有的特點，使它能實時動態觀測干細胞的轉歸，評價其安全性，分析選擇適合于不同組織修復的干細胞以及移植生物材料的篩選[47－48]，為摸索最佳的干細胞移植途徑、研究干細胞在體內復雜的生物過程提供了依據。同時，生物發光成像技術也存在一些需要改進的地方，如進一步優化熒光素酶報告基因，以減少光波在體內的吸收和散射；增加熒光素酶的組織特異性，增強在體內示蹤的敏感性，使生物發光成像能更廣泛地、更深層次地應用于干細胞領域的研究。

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Q786

B

1673－0364（2010）01－0052－04

2009年11月17日；

2010年1月6日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.016

上海市晨光計劃（09CG14），上海市科委科技人才計劃（08XD14025）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科。