骨髓基質細胞成骨誘導過程中細胞因子及細胞外基質蛋白作用的研究進展

解 芳 滕 利

·綜述·

骨髓基質細胞成骨誘導過程中細胞因子及細胞外基質蛋白作用的研究進展

解 芳 滕 利

目前，在骨組織工程研究中，各種細胞因子被廣泛應用于促進骨髓基質細胞（Bone marrow stem cells，BMSCs）的增殖、分化以及誘導中。細胞因子的家族成員種類繁多，各自的功能也較復雜，而且彼此之間還存在著協同或拮抗的作用。如何更好地應用這些誘導物質，促進BMSCs向成骨細胞分化，本文就該問題綜述如下。

1 概述

在細胞的增殖和分化過程中，有一系列的蛋白質起著關鍵作用。其中，一些是細胞自身分泌的（自分泌），另一些是通過鄰近細胞分泌的（旁分泌），這些蛋白質稱為細胞因子或生長因子。組織工程研究中常用的生長因子包括骨形成蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMP)、成纖維細胞生長因子（Fibroblastic growth factors，FGFs）、轉化生長因子（Transformating growth factor-β，TGF-β）、胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factor，IGF）等。它們能夠影響BMSCs的增殖、分化，促進血管內皮細胞的分裂、增殖，并合成細胞外基質，最終促進骨的生成。目前，通過對生長因子及細胞外基質蛋白的研究，揭示BMSCs分化成骨的分子機制，并在此基礎上探討應用外源性生長因子和細胞外基質蛋白促進BMSCs向成骨細胞分化的可能和途徑，已成為國內外學者研究的熱點。

2 生長因子

2.1 骨形成蛋白

BMP已成為骨組織工程研究中最重要的生長因子之一，尤其是其中的BMP-2和BMP-7[1]。

有實驗表明，對人BMSCs用重組人BMP-2（rhBMP-2）作用96 h后，不僅細胞堿性磷酸酶（ALP）值明顯升高，細胞量也明顯增多，與rhBMP-2濃度呈正相關。說明rhBMP-2對人BMSCs的增殖與成骨分化具有促進作用。Lecanda等[2]的研究證實，rhBMP-2能夠提高人BMSCs及肋骨來源的成骨細胞內的ALP、骨鈣素、Ⅰ型膠原mRNA的表達，但同時導致這兩種細胞的增殖受到抑制。

多數學者認為，BMP-2具有促進BMSCs增殖的作用。陳富林等[3]觀察了rh-BMP-2對培養的骨髓細胞生物學活性的影響，結果表明，低濃度的rhBMP-2（＜0.16 mg/L）對培養的骨髓細胞的ALP活性、蛋白質含量均有明顯的促進作用，且呈劑量依賴性；而高濃度的rhBMP-2（＞0.16 mg/L）對培養的骨髓細胞的增殖有一定促進作用，這證實了BMP不僅促進骨髓細胞向成骨細胞的表型轉化，而且可促進骨髓細胞的增殖。

有多項研究表明，rhBMP-2能明顯提高BMSCs在骨組織缺損中的修復能力，被認為是骨缺損修復中生長因子應用的良好選擇[4-7]。部分學者認為，BMP可以促進成骨細胞前體細胞向成骨細胞轉化，但不能使其向成熟成骨細胞轉化[8]。BMP在促進BMSCs向成骨細胞分化的同時，還可抑制其向其他細胞，如脂肪細胞、骨骼肌細胞等的分化。

BMP-6、BMP-7在體內外均有誘導骨源性干細胞分化的作用。轉染BMP-7基因的BMSCs不僅可促進其自身向成骨細胞的定向分化，同時也能促使未轉染的BMSCs的定向分化，最終獲得干細胞來源的成骨細胞，滿足組織工程研究中對種子細胞的要求[1]。Adeno-BMP7轉染可促進BMSCs的體外成骨定向分化，轉染后的BMSCs具有更強的體內成骨能力，可明顯促進新骨的形成，與未轉染的BMSCs相比，兩者有顯著差異[9]。

2.2 堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）

bFGF是一種25 kD的多肽，包括至少19個密切相關的單肽。bFGF對BMSCs具有極強的促增殖作用。bFGF不僅能提高BMSCs的增殖速度和壽命，而且能在增殖過程中保留BMSCs的多向分化潛能。bFGF還被證實具有促進血管生成的作用，可在骨組織工程中促進血管向植入物中生長，以利于成骨細胞的生長[1]。

有些學者認為，bFGF能夠促進細胞的貼壁和增殖，但對其分化成熟具有抑制作用。bFGF對成骨細胞分化作用不大，甚至可以阻止成骨細胞的分化。有研究發現，bFGF能有效促使未成熟的間質細胞分裂，如前軟骨細胞、前成骨細胞，而對成熟的分化較好的成骨細胞作用較弱，甚至有研究認為它對分化好的成骨、軟骨細胞有抑制作用，并抑制骨基質，如Ⅰ型膠原的合成[10]。但體內研究認為，bFGF能促進骨折愈合，防止骨不連[11]。

研究表明，bFGF和rhBMP聯合應用，對人BMSCs的增殖和ALP活性的表達均有顯著作用，其效應顯著大于單一因子的作用[12]。但外源性bFGF、rhBMP-2、TGF-β等，由于半衰期短，需反復大劑量使用，且價格昂貴。因此，目前多采用基因轉染方法促進人BMSCs表達生長因子，從而促進增殖、分化；或使用多種因子聯合應用的序貫治療，在序貫治療時常先使用促進增殖的細胞因子，然后再使用促進礦化的生長因子。

2.3 轉化生長因子-β

TGF-β是一族具有促進細胞增殖、調節細胞分化、促進細胞外基質合成的生長因子，對多種細胞具有促分化效應，是作用較強的促成骨分化的因子，能提高ALP的表達，并能減少和延遲BMSCs向脂肪細胞轉化，從而提高BMSCs的成骨效應[1]。TGF-β可以顯著提高軟骨細胞表型，促進培養的軟骨細胞表達多種類型的膠原和蛋白多糖[13]。TGF-β1被認為是促進MSCs形成軟骨的必要條件，沒有TGF-β1的情況下只產生很少量的葡萄糖胺聚糖。在體外培養狀態下，TGF-β對乳鼠成骨細胞的作用是雙向的。在低劑量下，在細胞密度達到近于匯合或高密度培養時，TGF-β明顯地促進DNA合成，促進成骨細胞增殖；而當濃度高于15 ng/mL時，或細胞在低密度培養時，則使成骨細胞的DNA合成受到抑制。在無血清培養條件下，TGF-β促使BMSCs向軟骨細胞轉化。

TGF-β、BMP-2可刺激體外培養的骨祖細胞增殖，TGF-β作用強于BMP-2，尤其是對早期的骨祖細胞。TGF-β對BMSCs的作用與細胞分化程度有關，早期可促進增殖，晚期則促進分化，但是TGF-β在體內無骨誘導作用[14]。

2.4 胰島素樣生長因子

IGF是一種半生長激素依賴性多肽，是骨組織中含量最為豐富的生長因子，能夠刺激骨細胞進行有絲分裂和分化，增加功能成熟的成骨細胞的數量和蛋白合成，在骨生成過程中,骨基質內IGF濃度明顯增高[1]。

Thomas等[15]對具有雙向分化潛能的hMS（3-4）的研究發現，IGF（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）能使細胞的增殖率增加2倍，但不改變CBFal、PPARZ（成骨細胞和脂肪細胞分化的調控因子）、ALP、Ⅰ型膠原、骨鈣素以及脂肪細胞系標志物脂蛋白脂肪酶Adipsin的表達；IGF明顯刺激Ⅰ型膠原在分化后的hMS（3-4）細胞及成熟成骨細胞中表達，增加分化脂肪細胞中脂滴的含量。這說明，IGFs對骨髓間充質細胞的分化與細胞所處的分化階段有關。

2.5 在各種細胞外基質蛋白中培養BMSCs

周江等[16]的研究表明，血管內皮細胞培養液提取液中含有多種生長因子，可以促進BMSCs向成骨細胞方向分化，與成骨誘導液效果相同。另外，孫源等[17]以BMSCs誘導內皮細胞（EC），使其能增強BMSCs的成骨活性，提高BMSCs的增殖能力。

骨細胞的培養液亦可用來促進BMSCs的成骨分化。Heino等[18]從骨細胞MLO-Y4的培養液中提取條件培養液，該培養液能促進BMSCs的增殖和向成骨細胞分化。Matsubara等[19]用從牛角膜內皮細胞中提取的類細胞外基質的基膜（b-ECM）上培養人BMSCs，結果顯示其生長率、增殖期和多向分化潛能均較只用塑料培養瓶者增加，而且在第5代時其骨唾液蛋白和鈣沉積的水平仍與第2代相當。Mauney等[20]用變性的Ⅰ型膠原基質培養BMSCs獲得類似的結果，細胞傳至11代時，鈣沉積、堿性磷酸酶活性、骨唾液蛋白和堿性磷酸酶表達與第1代相比仍維持在69%～95%之間，而且還保留了某些常規培養條件下喪失的功能，如熱休克蛋白70的表達等。

2.6 骨生長蛋白（OGP）

骨生長蛋白是新近發現的一種促骨形成因子，體內實驗發現它能刺激骨形成，增加小梁骨的密度。體外實驗則發現骨生長蛋白促進骨髓間充質細胞向成骨細胞的分化，但對其增殖作用則因種屬而異。Robinson等[21]的實驗表明，OGP可明顯刺激兔和人骨髓間充質細胞的ALP活性及礦化結節形成，但抑制兔BMSCs的增殖，促進人BMSCs的增殖。

2.7 瘦素（Leptin）

研究表明，瘦素能夠促進骨髓間充質細胞向成骨細胞分化，抑制其向脂肪細胞分化。瘦素可使人骨髓間充質細胞系hMS2-12的礦化能力增強，礦化基質增加59%，成骨細胞ALP、Ⅰ型膠原、骨鈣素mRNA及蛋白質表達均明顯增加；同時向脂肪細胞的分化減弱，脂肪細胞基因Adipsin和Leptin的mRNA表達下調，脂滴形成減少50%。但未發現Leptin對骨髓間充質細胞的增殖率有影響[22]。

2.8 甲狀旁腺激素（PTH）

甲狀旁腺激素對骨轉化具有雙向調節作用；大劑量給藥時有促進骨吸收的作用；小劑量時則能促進成骨前體細胞分化為成骨細胞，發揮促進骨形成的作用[1]。Kuznetsov等[23]研究表明，PTHrP是骨髓間充質組織生長和骨骼干細胞隔間的主要調節因子。持續應用PTH將促進骨吸收、導致骨丟失，間斷性小劑量應用PTH則促進骨形成、使骨量增加。Isogai等[24]將PTH作用于小鼠頭蓋骨成骨樣細胞，低密度接種時，ALP活性呈劑量依賴性增高；而高密度接種則抑制了ALP活性及骨鈣素表達。說明PTH對成骨細胞誘導分化與細胞接種密度及分化階段有關。

2.9 雌激素和孕激素

雌激素可有效預防婦女絕經后骨質疏松的發生，E2和抗骨質疏松藥物XW630可刺激成骨細胞的增殖活性[25]。17β-雌二醇可調節BMSCs向成骨細胞分化而減少其向脂肪細胞分化,并且可以抑制成骨細胞向脂肪細胞的橫向分化[26]。Delhon等[27]研究表明，雌激素相關受體α參與了成骨分化過程，它的沉默可以促進成骨分化和鈣沉積。

Shuanhu等[28]的研究，揭示了雌激素作用于雌激素受體α和雌激素受體b在BMSCs向成骨分化過程中發揮的作用不同，作用于前者時發揮正性的作用，而作用于后者時呈現負性作用。

孕激素對BMCSs有誘導作用，可增加細胞在體外培養時的礦化結節數量，刺激骨鈣素的分泌，但其作用主要針對培養早期的BMCSs，因而其作用目前尚存在爭議。

3 展望

在BMSCs向成骨細胞分化的過程中，多種細胞因子和細胞外基質起著重要的作用，目前的研究主要還集中在單一細胞因子的作用，對多種細胞因子的協同作用尚無定論，對于外源性細胞因子和細胞外基質作用的時間階段和途徑還需進一步探討。相信隨著BMSCs成骨分化的分子機制的深入研究，必將對臨床應用和研究產生重要的指導意義，推動骨組織工程的進一步發展。

[1]Deschaseaux F,Sensebe L,Heymann D.Mechanisms of bone repair and regeneration[J].Trends Mol Med,2009,15(9):417-429.

[2]Lecanda F,Avioli LV,Cheng SL.Regulation of bone matrix protein expression and induction of differentiation of human osteoblasts and human bone marrow stromal cells by bone morphogenetic protein-2 [J].J Cell Biochem,1997,67(3):386-396.

[3]陳富林,任衛紅,蒲勤,等.基因重組人骨形成蛋白-2對培養骨髓細胞的生物學效應[J].第四軍醫大學學報,1999,20(2):143-145.

[4]Jiang X,Zhao J,Wang S,et al.Mandibular repair in rats with premineralized silk scaffolds and BMP-2-modified bMSCs[J]. Biomaterials,2009,30(27):4522-4532.

[5]Jiang XQ,Sun XJ,Lai HC,et al.Maxillary sinus floor elevation using a tissue-engineered bone complex with beta-TCP and BMP-2 gene-modified bMSCs in rabbits[J].Clin Oral Implants Res,2009, [Epub ahead of print].

[6]林在俊,朱振安,湯亭亭,等.HA復合rhBMP-2轉染的BMSCs對羊脛骨延長骨愈合的影響[J].中國修復重建外科雜志,2008,22 (2):134-138.

[7]Xiao ZM,Jiang H,Zhan XL,et al.Treatment of osteonecrosis of femoral head with BMSCs-seeded bio-derived bone materials combined with rhBMP-2 in rabbits[J].Chin J Traumatol,2008, 11(3):165-170.

[8]Kim KJ,Itoh T,Kotake S.Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on human bone marrow cells cultured with various biomaterials[J].J Biomed Mater Res,1997,35(3):279-285.

[9]祝聯,陳付國,劉偉,等.骨髓基質干細胞轉染腺病毒BMP7后的成骨改變[J].中華整形外科雜志,2006,22(1):59-62.

[10]Weksler NB,Lunstrum GP,Reid ES,et al.Differential effects of FGF9 and FGF2 on proliferation,differentiation and terminal differentiation of chondrocytic cells in vitro[J].Bioehem J,1999, 342(3):677-682.

[11]Kawaguchi H,Nakamura K,Tabata Y,et al.Acceleration of fracture hearling in nonhuman primates by fibroblast growth factors-2[J]. J Clin Endocrinol Metab,2001,86(2):875-880.

[12]Wang L,Huang Y,Pan K,et al.Osteogenic responses to different concentrations/ratios of BMP-2 and bFGF in bone formation[J]. Ann Biomed Eng,2009,[Epub ahead of print].

[13]Kawamura K,Chu CR,Sobajima S,et al.Adenoviral-mediated transfer of TGF-b1 but not IGF-1 induces chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet cultures[J].Exp Hematol, 2005,33(8):865-872.

[14]Si X,Jin Y,Yang L,et al.Expression of BMP-2 and TGF-beta1 mRNA during healing of the rabbit mandible[J].Eur J Oral Sci, 1997,105(4):325-330.

[15]Thomas T GF,Spelsberg TC,et al.Response of bipotential human marrow stromal cells to insulin-like growth faetors:effect on binding protein production,proliferation,and commitment to osteoblasts and adipocytes[J].Endocrinology,1999,140:5036-5044.

[16]周江,吳江,唐戎,等.血管內皮細胞對骨髓基質干細胞促成骨作用的研究[J].生物醫學工程雜志,2003,20(3):447-450.

[17]孫源,林紅,吳子征,等.聯合培養時誘導的內皮細胞對自體骨髓基質干細胞成骨作用的影響[J].中華創傷骨科雜志,2006,8(10): 919-923

[18]Heino TJ,Hentunen TA,Vaananen HK.Conditioned medium from osteocytes stimulates the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and their differentiation into ostcoblasts[J].Exp Cell Res,2004,294(2):458-468.

[19]Matsubara T,Pan H,Oda R,et al.A newtechnique to expand human mesenchymal stemcells using basement membrane extracellular matrix[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,313(3):503-508.

[20]Joshua RM,David LK,Vladimir V.Matrix-mediated retention of osteogenic differentiation potential by human adult bone marrow stromal cells during ex vivo expansion[J].Biomaterials,2004,25 (16):3233-3243.

[21]Robinson D,Bab I,Nevo Z.Osteogenic growth peptide regulates proliferation and osteogenic maturation of human and rabbit bone marrow stromal cells[J].J Bone Miner Res,1995,10(5):690-696.

[22]Thierry T,Francesca G,Sundeep K,et al.Leptin acts on human marrow stromal cells to enhance differentiation to osteoblasts and to inhibit differentiation to adipocytes[J].Endocrinology,1999, 140(4):1630-1638.

[23]Kuznetsov SA,Riminucci M,Ziran N,et al.The interplay of osteogenesis and hematopoiesis:expression of a constitutively active PTH/PTHrP receptor in osteogenic cells perturbs the establishment of hematopoiesis in bone and of skeletal stem cells in the bone marrow[J].J Cell Biol,2004,167:1113-1122.

[24]Isogal Y,Akatsu T,Ishizuya T,et al.Parathyroid hormone regulates osteoblast differentiation positively or negatively depending on the differentiation stages[J].J Bone Miner Res,1996,11(10):1576-1594.

[25]張志媛,張鋒.雌激素及XW630對類成骨細胞增殖及堿性磷酸酶活性的影響[J].生殖醫學雜志,1995,4(3):146-149.

[26]李湘輝,張金超,劉長振,等.17β-雌二醇對骨髓基質細胞成骨、成脂分化和成骨細胞成脂橫向分化的影響[J].中國藥學雜志, 2006,41(17):1306-1315.

[27]Delhon I,Gutzwiller S,Morvan F,et al.Absence of estrogen receptorrelated-alpha increases osteoblastic differentiation and cancellous bone mineral density[J].Endocrinology,2009,150(10):4463-4472.

[28]Shuanhu Z,Yoram Z,Karsten W,et al.Estrogen modulates estrogen receptor α and β expression,osteogenic activity,and apoptosis in mesenchymal stem cells(MSCs)of osteoporotic mice[J].J Cell Bioche,2001,81(36):144-155.

R786，Q813.1+1

B

1673－0364（2010）01－0049－03

2009年11月19日；

2009年12月23日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.015

衛生部臨床學科重點項目（3030426-04）。

100144北京市中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院。