維A酸結合蛋白I折疊/伸展過程的氫/氘交換質譜研究

張 琳,謝建英

(廣東海洋大學理學院,廣東湛江 524088)

蛋白折疊/伸展一直是生物化學中最重要的問題之一,蛋白的結構變化通常都伴隨著蛋白功能的改變,因此對蛋白質結構及其與生物功能關系的研究也是當代分子生物學的核心領域之一。氫/氘交換(HDX)對蛋白結構非常敏感,蛋白的結構不同在不同位置的交換速率也不同,此即HDX可用來研究蛋白的折疊/伸展動力學的緣故[1-2]。氫/氘交換的速率主要由2個因素確定,即與溶劑的可接觸性和氫鍵作用。形成分子內氫鍵的氫比那些與溶劑水形成氫鍵的氫交換速率慢,而那些包埋在溶劑內未形成氫鍵的氫交換速率更慢。傳統的氫/氘交換技術通常與核磁共振相結合,而這種方法最大的缺陷在于需預先確定所討論的蛋白的核磁共振譜,這意味著要耗費大量的工作;并且核磁共振對檢測物的濃度要求也較高。質譜(MS)技術的發展使其能夠精確地測定蛋白的分子質量,如果蛋白中的氫部分被氘取代,蛋白分子質量的增加就會在質譜圖上反映出來,且質譜所需分析物的量很少,因此現代質譜技術可廣泛用于蛋白質中氫/氘交換的檢測[3-8],由此探尋蛋白的結構信息。

維A酸結合蛋白I(CRABP I)是細胞內脂結合蛋白家族之一,它具有136個氨基酸殘基,組成10個條形β折疊和一小段α螺旋,其結構簡單,既沒有二硫鍵,也沒有輔基或轉譯后的修飾,非常適合蛋白的折疊/伸展研究。本研究采用氫/氘交換技術與傅里葉變換離子回旋共振質譜(FT-ICR MS)相結合,檢測氘代維A酸結合蛋白(D-CRABP I)在水溶液中的伸展過程,并討論p H值的變化對蛋白伸展的影響。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

傅里葉變換離子回旋共振質譜儀(4.7T,APEX III):德國 Bruker公司產品;p HS-3C p H計。

1.2 主要材料與試劑

CRABP I按文獻[9]方法表達,氘水及氘代醋酸購自Aldrich公司,其他藥品為市售分析純試劑。

1.3 試驗條件

1.3.1 H/D交換 將冷凍干燥的蛋白溶于pD=3的氘水和氘代醋酸溶液中(1 g·L-1),45℃恒溫20 min,得到D-CRABP I。HDX反應的進行是將D-CRABP I以1∶20溶于10 mmol·L-1醋酸水溶液中,緊接著將蛋白溶液注入質譜儀進行檢測。試驗中的p H值和pD值均由p H計直接測得,未考慮同位素效應的影響。

1.3.2 質譜條件 質譜儀為配備4.7 Tesla超導磁體的傅里葉變換離子回旋共振質譜儀APEX III。噴霧電壓2 500 V,毛細管溫度120℃,離子檢測激發電壓5.0 V,離子源內真空度6.4×10-5Pa,注射泵流速250 mL·h-1。

2 結果與討論

2.1 不同pH值下蛋白的氫/氘交換質譜圖

氫/氘交換質譜的測量可作為研究蛋白結構變化的重要工具,其譜圖可用來檢測蛋白質折疊/伸展過程的各種結構形式。通過檢測p H 2.0～11范圍內的氘/氫交換質譜,發現p H 2.8～10的質譜圖與p H 2.0～2.5和p H 10～11的譜圖存在明顯的差別。p H 2.5和p H 3.5時,D-CRABP I與水溶液中氫相互交換的 FT-ICR MS譜圖示于圖 1和圖 2。在 p H 2.5時,CRABP I的氫/氘交換展示了與p H 3.5時完全不同的同位素譜圖形式,這種差別可能歸因于它們不同的交換反應機理。

2.2 不同pH值下的氫/氘交換機理

雖然氫/氘交換的反應機理尚未完全明了,但人們普遍接受的是由Linderstr?m-Lang提出,并經 Hvidt和 Nielsen改進的二狀態模型[10-11]。該模型假設氫/氘交換由兩個過程決定:一個是通過蛋白的伸展/折疊將其骨架伸展使之暴露于溶劑中的過程;另一個是蛋白結構中的氫(氘)與溶劑中的氘(氫)相互交換的過程。氫與氘的交換機理取決于這兩個過程的相對速率。如果蛋白伸展/折疊互換速率比其結構中的氫與溶劑中的氘互換速率快,氫/氘交換遵循EX2機理,質譜圖僅顯示一組隨時間逐漸漂移的同位素離子峰。如p H 2.5時 CRABP I的氫/氘交換,隨著時間的推移,CRABP I的[M+8H]8+峰逐漸向分子質量低的方向移動,表示蛋白中的氘逐漸被溶液中的氫取代。反之,如果蛋白伸展/折疊互換速率比其結構中的氫與溶劑中的氘互換速率慢,氫/氘交換則遵循 EX1機理,質譜譜圖中出現兩組同位素離子峰,其中 m/z值低的一組峰在氫/氘交換的開始并不存在,而是在交換過程中逐漸生長出來的,它代表蛋白中氘被氫取代的一部分;而 m/z值高的一組峰在交換過程中逐漸消失,該離子峰代表原來的氘代蛋白部分,如p H 3.5時 CRABP I的氫/氘交換。從圖2可以看出,在 m/z值不同的兩組峰此消彼長的同時,還伴有兩組峰同時向 m/z值減小的方向移動的現象,這說明氫/氘交換不僅遵循 EX1交換機理,還伴有EX2交換機理。

圖1 pH2.5時氘代CRABP I的[M+8H]8+氫/氘交換質譜圖Fig.1 H/D exchange mass spectra of[M+8H]8+of D-CRABP I at pH2.5

2.3 未交換氫(氘)數的計算

蛋白結構中存在3種類型的氫原子:第1種是蛋白骨架中與骨架碳共價結合的氫,這種氫不能進行氫/氘交換;第2種為蛋白支鏈上的氫,這種氫因交換速率極快故很難測定;第3種是蛋白骨架上與胺基氮相連的氫,其交換速率最容易被檢測。除脯氨酸外,每個氨基酸都有1個與胺基氮相連的氫,且它們在蛋白的二級結構中參與了氫鍵的形成,因此它們的交換速率反映了蛋白的結構及其穩定性的信息。CRABP I分子中共存在260個可交換的氫,其中與胺基氮相連的氫132個。由于氘與氫的分子質量相差1 u,對于完全氘代的D-CRABP I,當分子內有一個位置的氘被溶劑中的氫產生交換時,蛋白分子的分子質量將減少1 u。D-CRABP I[M+8H]8+峰的m/z為1 966.05,當支鏈上的氘全部被氫取代時,[M+8H]8+峰 m/z為 1 949.55。無論在p H 2.5還是p H 3.5的條件下,氫/氘交換實驗進行1 min后,[M+8H]8+峰的 m/z均小于1 949.55,表明蛋白支鏈上的氘在很短時間內就被溶劑中的氫完全取代。蛋白分子中氫/氘交換的數目可以根據其質譜圖中同位素峰的m/z值來進行估算,如交換5 min后,CRABP I的[M+8H]8+峰在p H 2.5時 m/z為1 946.9,對應的蛋白分子質量為15 567.2 u,而CRABP I的平均分子質量是15 460.4 u,故此時約有107個氘尚未被氫取代;p H 3.5時,交換5 min后[M+8H]8+峰的 m/z為1 947.3(m/z較高者),對應的分子質量為15 570.4 u,即尚有110個氘未被氫所取代。同樣可算出其他交換時間DCRABP I中未被氫所取代的氘的數目,示于圖3。需要說明的是,未交換的氘是以質譜中同位素峰的中心點為依據進行計算的,由于存在較寬的同位素分布,要精確地確定同位素峰的中心點還有一定的困難,因此,計算所得的未交換的氘的數目只能作為半定量的分析結果。從圖3還可以看出,CRABP I在p H 2.5時氫/氘交換速率比 p H 3.5時的交換速率快,這是由于CRABP I在p H 2.5以下會發生蛋白變性而使其結構展開,從而導致氫/氘交換速率變快。

圖2 pH3.5時氘代CRABP I的[M+8H]8+氫/氘交換質譜圖Fig.2 H/D exchange mass spectra of[M+8H]8+of D-CRABP Iat pH3.5

3 結論

氫/氘交換傅里葉變換離子回旋共振質譜可用于檢測蛋白結構信息,它對p H值非常敏感。CRABP I的[M+8H]8+峰在不同的p H值范圍呈現不同的交換機理,p H 3.5時,質譜圖中出現兩組同位素離子峰,其中 m/z值低的一組峰在交換過程中逐漸增長,而另一組 m/z值較高的峰在交換過程中逐漸消失,遵循 EX1交換機理;當p H 2.5時,質譜圖中只出現一組同位素離子峰,它隨時間逐漸向 m/z值減小的方向移動,遵循EX2交換機理。

圖3 不同氫/氘交換時間氘代CRABP I中余留的氘的數目Fig.3 The number of deuterium remained in D-CRABP I at different H/D exchange time

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