綿羊β3腎上腺素能受體基因多態性分析

武建亮，許登高，喬利英，劉文忠

（山西農業大學動物科技學院，太谷 030801）

β3腎上腺素能受體 （beta－3 adrenergic receptor，ADRB3）是一種G蛋白耦聯的膜表面受體，屬于G蛋白耦聯受體超家族的成員之一。具有調節脂肪分解和能量消耗的作用，其生理功能主要是作用于脂肪組織，通過交感神經系統來刺激褐色脂肪組織和白色脂肪組織中的脂肪分解產生熱量［1］。在人類中ADRB3編碼的蛋白質序列在64位點存在Trp64Arg突變，而Trp64Arg突變可減弱脂肪分解的活性［2］，Trp64Arg多態性還與肥胖、2－型糖尿病、高血壓等癥狀有密切關系［3－4］。在綿羊ADRB3基因中，共檢出 13 種不同的基因型［5－6］，ADRB3 多態性與羔羊的存活率、初生重和胴體組成都存在關聯效應［7－9］。對ADRB3基因多態性的研究為綿羊分子育種體系的建立提供重要的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究以12個綿羊品種（系）為研究對象，共采集962只個體的血液樣品。其中廣靈大尾羊（Guangling Fat－tailed sheep，GLT，n＝35）、大尾寒羊（Fattailed Han sheep，LTH，n＝22）、小尾寒羊（Small－tailed Han sheep，STH，n＝146）、晉中綿羊（Jinzhong sheep，JZH，n＝40）、山西肉用綿羊（Shanxi Dam Line，SDL，n＝270）、山西細毛羊（Shanxi Fine－wooled sheep，SFW，n＝40）、杜泊羊（Dorpor，DRP，n=45）、考力代羊（Corriedale，CRD，n=53）、特克塞爾羊 （Texel，TXL，n=38）、南非肉用美利奴羊（South Africa Mutton Merino，SMM，n=198）、陶賽特羊（Polled Dorset，DST，n=36）、德國肉用美利奴羊（German Mutton Merino，GMM，n=39）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用酚-氯仿抽提法提取綿羊全基因組DNA。

1.2.2 PCR-SSCP分析 根據GenBank公布的綿羊ADRB3基因序列（登錄號：DQ269497），通過軟件Primer 5.0自行設計1對引物。引物序列為：Forward 5’-CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC-3’和 Reverse 5’-CCCAACTCCCAACCCGATC-3’，由上海英駿生物有限公司合成。擴增產物為綿羊ADRB3基因部分內含子序列，擴增片段長度為265 bp。PCR擴增采用15 μL體系，PCR擴增程序為：94℃預變性4 min，35個循環（94℃變性30 s，63℃退火 30 s，72℃延伸 30 s），72℃延伸 10 min，4℃保存。PCR擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，取2 μL PCR擴增產物加入8 μL變性緩沖液，經98℃熱變性10 min，立即置于冰上冰浴10 min，取10 μL經過8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。電泳條件：4℃、120 V、5 W電泳12 h。采用硝酸銀染色法染色，凝膠成像系統成像后判斷帶型。

1.2.3 克隆測序 通過PCR-SSCP檢測后挑選不同基因型的個體進行克隆測序。將PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈割膠，用試劑盒純化回收后，用pMG-T載體連接試劑盒（北京天根）連接轉化，篩選陽性克隆經質粒提取檢測后送北京諾塞基因有限公司測序。

1.3 數據分析 用 Goudel（2001） 的 FSTAT（Version 2.9.3）軟件計算每個品種（系）該基因位點的等位基因頻率、等位基因豐度（rs）和基因多樣性（Hs）。基因多樣性的計算公式如下：

式中，nk為第i個種群的個體數，Pik為第k個種群中Ai的等位基因頻率，Hok為第k個種群的觀察雜合度。用Popgene 3.2軟件計算有效等位基因數（Ne）。用MEGA 4.0軟件進行序列比對。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果 圖1為PCR擴增產物檢測結果。由圖1可見，引物PCR擴增產物大小與預期結果一致，擴增條帶整齊、特異性強、產量高，結果理想，可用于后續研究。

圖1 PCR擴增產物檢測結果

2.2 PCR-SSCP分析 對ADRB3基因5’端設計的引物擴增片段長265 bp，適合做SSCP分析。通過對12個品種（系）962個個體的PCR-SSCP檢測，聚丙烯酰胺凝膠電泳結果發現，所研究綿羊的ADRB3基因在該擴增片段上存在多態性，共檢測出 A、B、C、D、E、F、G 和 H 八種不同帶型，分別代表8種不同的基因型。

圖2 綿羊ADRB3基因的PCR-SSCP結果

2.3 綿羊ADRB3基因遺傳多態性分析

2.3.1 等位基因頻率 在所檢測的ADRB3基因位點中有多態性，共檢測到8種等位基因。該基因片段的不同基因型在12個綿羊品種（系）中的頻率列于表1。在不同的綿羊品種（系）中所檢出的基因型也有所不同，基因型B和C在12個品種（系）中頻率較高，為優勢基因型，基因型H只在南非肉用美利奴綿羊中檢出，為該綿羊品種特有的基因型。

表1 各基因型在不同綿羊品種中的頻率

2.3.2 有效等位基因數和等位基因豐度 就本研究中綿羊ADRB3基因位點而言，總群體有效等位基因數為2.240，等位基因豐度即獨立于樣本大小的等位基因數為6.515（表2）。有效等位基因數最多的為小尾寒羊，等位基因豐度最高的為廣靈大尾羊，有效等位基因數和等位基因豐度最小的種群均是山西細毛羊。

2.3.3 基因多樣性 12個綿羊品種（系）中，ADRB3基因位點的基因多樣性范圍為0.050～0.729（表2），山西細毛羊的最小，小尾寒羊的最大，除山西細毛綿羊外，ADRB3基因在不同綿羊品種（系）中均表現出高度或中度多態性，具有較高的遺傳多樣性。

2.4 綿羊ADRB3基因部分序列核苷酸變異 序列測定及比對結果表明，8種不同基因型中共包含10個SNPs，其中基因型A包含一個A堿基的插入。綿羊ADRB3基因部分序列核苷酸變異與基因型情況見表3。

表2 不同綿羊品種（系）中有效等位基因數、等位基因豐度和基因多樣性無偏估計值

表3 綿羊ADRB3基因部分序列核苷酸變異與基因型

3 討論

3.1 綿羊ADRB3基因多樣性 本研究通過PCR－SSCP對綿羊ADRB3基因多態性分析，共檢出8種不同的基因型，這與Byun等［5］對新西蘭綿羊檢測出8種基因型和Yang等［6］對中國藏系綿羊檢測出13種基因型的結果是相似的，都表明綿羊ADRB3基因存在較高的遺傳多樣性。而造成差異的原因可能是所研究的綿羊品種（系）不同而導致的，也可能是所選取的該基因序列片段不同而引起的。Forrest等［7－9］的研究表明，ADRB3 基因的不同基因型與羔羊的初生重、日增重、胴體組成以及羔羊的抗寒性存在著關聯效應。因此基于ADRB3多態性與綿羊不同的生長、生產性能之間的關聯性應該進行更進一步的研究。

3.2 綿羊遺傳資源的保護 從前人的研究和本實驗的研究來看，山西地方綿羊品種相對來說具有豐富的遺傳資源，是人類寶貴的基因庫，應該加以保護和利用［10－11］。本研究對ADRB3基因的遺傳多樣性檢測，為我國綿羊的地方品種遺傳資源提供了一些依據。就山西地方綿羊品種而言，晉中綿羊和廣靈大尾羊的基因多樣性值均大于0.5，表明其遺傳多樣性較為豐富，而山西細毛羊的基因多樣性值僅為0.05，說明其遺傳多樣性貧乏，應該給予重視，加以保種。尤其是隨著畜禽品種雜交改良的開展，大量國外優良高產品種的引入以及近年來農業產業結構的調整等因素的影響，晉中綿羊和廣靈大尾羊也不可避免地受到沖擊，如果不及時對晉中綿羊和廣靈大尾羊進行品種特性研究和保護，晉中綿羊和廣靈大尾羊將重蹈我國其它瀕危或已滅絕的地方家畜品種的覆轍。從生物遺傳多樣性和畜牧業可持續發展的角度來看，對該品種的保護已刻不容緩。

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