波爾山羊和山西省地方山羊品種微衛星DNA多態性分析及群體間雜種優勢預測

毛楊毅,羅惠娣,郭慧慧,張喜中,王志武,李 俊,王棟才,張冠武,韓一超,田 輝

(山西省農科院畜牧獸醫研究所,太原 030032)

山西省是我國養羊大省,具有豐富的山羊品種資源。黎城大青羊、陽城白山羊、呂梁黑山羊[1-2]以及洪洞奶山羊都是山西著名的山羊業的主要生產資料,具有生產性能良好、適應性強、耐粗飼等優良品質。近年來,為適應羊肉生產發展的需要,引入波爾山羊及南江黃羊等與本地品種進行了試驗性雜交,以期建立成熟的雜交繁育生產體系,為山西山羊羊肉生產奠定基礎。在山羊生產實踐中,雜種優勢的預測及其利用日益重要,但傳統的雜種優勢預測需要進行雜交試驗和配合力測定,既費時又費力。隨著分子生物學技術的發展,基于DNA多態性的分子標記的產生為解決這些問題開創了新的途徑。

微衛星是DNA序列中以2～6個短核苷酸為基本單位,重復10～20次,分布于生物整個基因組。因數量多、分布廣、多態性豐富、呈共顯性遺傳以及檢測快速方便等優點而倍受推崇,已被廣泛應用于遺傳連鎖圖譜構建、數量性狀基因定位、遺傳多樣性評估等方面。此外,微衛星DNA多態性還被應用于動物雜交優勢的預測。通過各品種在不同微衛星座位的等位基因頻率計算出品種間的遺傳距離,了解其血緣關系的遠近以預測雜種優勢的大小。

在國內其它省區,瞿冬艷等[3]用微衛星DNA對寧夏牧區主要綿羊群體的遺傳多態性進行了分析,并據此預測了雜種優勢;張英杰等[4]則在利用微衛星DNA分析3個山羊群體和部分綿羊品種遺傳多態性的基礎上,對預測的雜種優勢進行了實際雜交驗證。武艷平等[5]用微衛星標記研究我國部分山羊群體遺傳結構變異;李步高等[6]、常新建等[7]分別用RAPD技術和微衛星標記分析山西省部分山羊品種和外來部分山羊品種的遺傳親緣關系。但用微衛星標記對山西省4個地方山羊品種及波爾山羊的遺傳多樣性及親緣關系進行系統研究未見報道。本研究利用微衛星DNA從分子水平上分析5個山羊品種的遺傳多態性,計算了群體間的遺傳距離,據此對波爾山羊與4個地方品種間的雜種優勢做了預測,旨在為山西省進行山羊雜交改良、新品種培育等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測樣品 2008年3—11月,在各品種內采取特征明顯的40只羊的耳組織樣品,共采集樣品200份,放進裝有70%～75%酒精的保溫壺中帶回實驗室。其中黎城大青羊(LC)采自黎城縣種羊場,陽城白山羊(YC)采自陽城白山羊種羊場,呂梁黑山羊(LL)采自興縣高效生態養羊繁殖示范基地,洪洞奶山羊(HD)采自洪洞奶山羊育種場,波爾山羊(Boer)采自山西省農科院畜牧獸醫研究所種羊場。

1.1.2 微衛星座位及引物序列 微衛星座位、引物序列、染色體位置等相關信息均來自www.ncbi.nlm.nih.gov和www.marc.usda.gov兩個網站,見表1。引物由北京奧科生物技術有限公司合成。

表1 5對微衛星引物的信息

1.1.3 主要試劑 10×buffer、dNTP 、Mg2+、Taq酶、T ris平衡酚、丙烯酰胺等試劑均由太原市來寶生物工程有限公司提供;pBR322 DNA/Msp1由天根生化科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用酚-氯仿抽提法[8]。

1.2.2 PCR擴增 PCR反應體系:反應體系10 μ L,其中各組分的終濃度或劑量分別為:1～2×buffer,dNTPs 100～400μ M,primer 1和primer 2各0.2～0.4 μ M,Mg2+1.5 ～ 2.0 mM,Taq 酶 0.5～ 1.0 u,基因組DNA 20～40 ng。PCR反應程序:94℃預變性5 min;94℃變性 30 s,50～64℃退火 50 s,72℃延伸 1 min,共35個循環;72℃終末延伸5 min。

1.2.3 等位基因分離及大小計算 用8%～12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離微衛星等位基因,經硝酸銀染色后,用WD-9413A凝膠成像系統拍照保存。再以pBR322 DNA/Msp1 Marker為標準,利用ONE-Dscan軟件計算等位基因大小。

1.2.4 數據統計 參考引用相關文獻[9],對數據進行統計分析。利用 Mstools、Fstat、Popgene、dispan 等軟件計算每個品種在各位點等位基因頻率(P)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態信息含量(PIC)、等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、總群體遺傳分化系數(Gst)、品種間標準遺傳距離(DS)。

2 結果

2.1 PCR擴增產物聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離 將5個山羊品種在5個微衛星位點PCR擴增產物用8%～12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離DNA片段,PCR產物電泳結果參見圖1。從圖1可見,PCR產物擴增以及基因分離效果良好。根據等位基因片段大小分別記錄為 a、b、c、d……等。

圖1 呂梁黑山羊(LL)BM6526位點PCR擴增產物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.2 品種的遺傳多樣性 由表2可知,5個微衛星位點在5個山羊品種中共檢測到70.0個等位基因,各位點檢測到等位基因數9.0～21.0個,平均14.0個。黎城大青羊、陽城白山羊、呂梁黑山羊、洪洞奶山羊、波爾山羊在5個微衛星位點檢測到的等位基因數分別為:46.0、37.0、42.0、35.0、36.0個。依據等位基因組成,運用Mstools軟件計算等位基因頻率。

表2 5個山羊品種各微衛星位點等位基因數

各品種在各位點觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態信息含量(PIC)、有效等位基因數(Ne)及平均 Ho、He、PIC、Ne等(表3)的計算,基于等位基因組成及頻率,運用Mstools和popgene軟件。5個微衛星座位的有效等位基因數3.33～15.46個,平均7.99個。BM6526座位最多,MB056座位最少。5個山羊品種在5個微衛星位點平均有效等位基因數順序為:黎城大青羊＞呂梁黑山羊＞陽城白山羊＞波爾山羊＞洪洞奶山羊。

利用5個微衛星標記在檢測5個山羊品種遺傳多態信息含量時,除MB056位點在洪洞奶山羊多態信息含量0.444 6(0.25＜PIC＜0.5)為中度多態位點外,其它PIC＞0.5均為高度多態位點。5個山羊品種在5個微衛星位點平均遺傳多態信息含量以黎城大青羊最高,洪洞奶山羊最低。

各微衛星位點基因雜合度在0.701 7～0.937 6之間,BM6526位點較大,MB056位點較小;5個山羊品種在5個微衛星位點平均基因雜合度順序為:黎城大青羊＞陽城白山羊＞呂梁黑山羊＞波爾山羊＞洪洞奶山羊。此結果與多態信息含量結果相一致。

表3 5個山羊品種在各微衛星位點的有效等位基因數、基因雜合度、多態信息含量

2.3 品種間遺傳分化 根據等位基因組成及頻率,使用popgene、dispan軟件,計算出在5個微衛星點在各山羊品種間遺傳分化系數(表4)、標準遺傳距離(表5)。由表4可知,在5個微衛星位點上,URB037位點遺傳分化系數最大(0.080 6),MB056位點最小(0.030 6),平均0.060 7。表明5個微衛星位點上各山羊品種間遺傳變異占總群體遺傳變異的6.07%,93.93%遺傳變異發生在品種內,可見品種間遺傳變異不大。

由表5可知,波爾山羊與呂梁黑山羊遺傳距離最大(0.508 3),與陽城白山羊(0.447 4)和洪洞奶山羊(0.433 2)次之,與黎城大青羊最小(0.330 1);黎城大青羊與陽城白山羊間遺傳距離最小(0.082 0),依次為黎城大青羊、陽城白山羊與呂梁黑山羊(0.107 0)、(0.153 0),呂梁黑山羊、陽城白山羊、黎城大青羊與洪洞奶山羊(0.304 2)、(0.337 4)、(0.353 5),波爾山羊與黎城大青羊、洪洞奶山羊、陽城白山羊、呂梁黑山羊間為最大。

表4 5個微衛星位點的總群體基因多樣度(Ht)、群體內基因多樣度(Hs)及基因分化系數(Gst)

表5 5個山羊品種間遺傳距離

3 討論

3.1 品種遺傳變異分析 等位基因是衡量微衛星座位多態性的一個重要參數。根據微衛星標記選擇標準,每個微衛星位點至少應有4個等位基因方能較好地用于遺傳多樣性的評估[10]。本研究結果為:5個山羊品種在各微衛星位點的等位基因數都在4.0個以上,各位點檢測到的等位基因數為9.0～21.0個,均比報道的多,說明選擇的5個微衛星座位多態性豐富,可用于5個山羊品種遺傳多樣性的評估。

有效等位基因數(Ne)、基因雜合度(H)、遺傳多態信息含量(PIC)都是衡量品種內遺傳變異程度及座位多態信息量的指標[11]。趙艷紅等[12]、武艷平等[5]、常新建等[7]、王杰等[13]、潘建文等[14]用微衛星標記分別分析了中國部分山羊群體及山西、四川、福建省部分地方山羊品種的遺傳多樣性,結果為:中國6個山羊群體平均有效等位基因數為2.571～4.915個,平均多態信息含量在0.533 0～0.639 0之間,平均遺傳雜合度在0.367 0～0.467 0之間;我國5個山羊品種平均有效等位基因數為4.66～6.05個,平均多態信息含量在0.724 0～0.784 0之間,平均遺傳雜合度在0.768 0～0.820 0之間;5個山羊群體平均有效等位基因數為7.776 5～11.506 0個,平均多態信息含量在0.834 1～0.902 6之間,平均遺傳雜合度在0.859 4～0.911 5之間;四川9個黑山羊品種平均有效等位基因數4.273～5.281個,平均多態信息含量在0.697 0～0.770 0之間,平均遺傳雜合度在0.742 0～0.801 0之間;福建地方山羊品種平均有效等位基因數4.46～5.60個,平均多態信息含量在0.729 4～0.780 8之間,平均遺傳雜合度在0.767 2～0.807 9之間。本研究的結果為:5個山羊品種平均有效等位基因數為4.94～6.05個,平均遺傳多態信息含量在0.705 3～0.798 2之間,平均基因雜合度在0.759 2～0.831 6之間?？梢姳狙芯拷Y果與武艷平等[5]、王杰等[13]、潘建文等[14]的結果相似,略高于趙艷紅等的結果[12],略低于常新建等的結果[7]。結果表明,5個山羊品種遺傳變異程度高、多態性豐富及選擇潛力大;5個微衛星位點均為高度多態位點、多態信息量大,能夠從分子水平上反映5個山羊品種內遺傳變異及品種間遺傳關系,可作為有效遺傳標記用于山羊品種的遺傳多樣性及系統發生樹的構建分析。

另外,在5個山羊品種中,黎城大青羊的平均有效等位基因數、基因雜合度、多態信息含量3項指標最大,而洪洞奶山羊最小,表明黎城大青羊的遺傳變異程度較其它4個山羊品種大,而洪洞奶山羊則小。這可能是洪洞奶山羊目前數量較少、遺傳資源不廣泛造成的原因。

3.2 品種間親緣關系分析 遺傳距離是度量品種間、物種間遺傳變異及基因差異程度的某種數值。李步高等[6]、常新建等[7]分別用RAPD技術、微衛星標記研究波爾山羊與山西部分地方山羊品種間遺傳距離,結果均為波爾山羊與呂梁黑山羊間遺傳距離大于與黎城大青羊間遺傳距離。本實驗結果:波爾山羊與山西4個地方山羊品種間標準遺傳距離(DS)順序為:波爾山羊與呂梁黑山羊＞波爾山羊與陽城白山羊＞波爾山羊與洪洞奶山羊＞波爾山羊與黎城大青羊。此結果與李步高等[6]、常新建等[7]研究結果基本一致。

3.3 雜種優勢推測 雜種優勢理論認為[15],雜種優勢的大小在一定程度上取決于親本間的遺傳差異大小,即親本間遺傳距離。遺傳距離越大,遺傳分化越大,雜交優勢越大,雜交效果越好。瞿冬艷等[3]用微衛星標記分析寧夏牧區主要綿羊群體間遺傳距離,并預測雜種優勢;張英杰等[4]在用微衛星DNA分別進行3個山羊群體間、5個綿羊品種間遺傳距離分析的基礎上,對預測的雜種優勢做了實際雜交驗證。李步高等[6]用RAPD技術對波爾山羊與山西部分地方山羊品種間遺傳距離進行研究,得出波爾山羊與呂梁黑山羊的雜種優勢較與其它幾個品種大。據本研究結果,波爾山羊與呂梁黑山羊雜交,可望獲得較大的雜種優勢,與陽城白山羊和洪洞奶山羊的雜種優勢次之,與黎城大青羊的雜種優勢較小。此結果與李步高等[6]研究結果基本一致。

致謝:黎城縣種羊場、陽城白山羊種羊場、興縣高效生態養羊繁殖示范基地、洪洞奶山羊育種場的同仁們對本文采集樣品的支持。

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