國內綿羊高繁殖力基因的研究和應用

王 旭,買買提伊明?巴拉提

(新疆農業大學動物科學學院,烏魯木齊 830052)

綿羊多為季節性發情和一胎單羔,在世界綿羊品種庫的近700個綿羊品種中只有少數具有產羔數多、性成熟早和常年發情的特點,因此高繁殖力的綿羊具有廣闊的發展前景。

產羔數常作為衡量綿羊繁殖力的重要指標,但因綿羊產羔性狀的遺傳力很低(0.03～0.1),所以單純的表觀選擇很難提高這一性狀,同時多胎性狀受基因優劣、年齡大小、季節變化和營養狀況等內外因素的影響,其中基因是影響綿羊多胎性狀的一個最主要的因素,因此通過對綿羊多胎主效基因的研究可為綿羊的輔助育種提供素材,并可建立迅速提高綿羊產羔性能的育種方法。

1 常見的高繁殖力基因

1.1 FecB基因

FecB基因最早是在Booroola綿羊上發現的,也是目前研究最為成熟的控制綿羊高繁殖力的主效基因,該基因于1989年由綿山羊遺傳命名委員會正式命名。Piper等[1-2]研究發現該基因是由常染色體上控制繁殖性狀的基因發生突變所致,具有提高排卵數和產羔數等生物學作用；一個拷貝的FecB基因平均可增加排卵數1.65個,增加產羔數0.9～1.2只；兩個拷貝平均增加排卵數2.7～3.0個,增加產羔數1.1～1.7只。

Wilson等[3]、Souza等[4]和 Mulsant等[5]幾乎同時發現FecB基因所在的綿羊6號染色體區域同線性的人4號染色體q22～q23上的骨形態發生蛋白受體IB基因(bone morphogenetic protein-IB gene,BMPRIB)與Booroola綿羊的排卵率存在關聯。BMPR-IB基因調節生長和分化的多功能蛋白,所在區域含有FecB位點,該基因編碼序列長1 509 bp,由10個外顯子組成,編碼502個氨基酸。Souza等[4]的研究發現BMPR-IB的激酶區域有2個點突變,其中1個突變為編碼區746堿基(A→G)的突變,該點突變使非突變型的谷氨酰胺變成Booroola羊的精氨酸(Q249R),并證明Q249R就是FecB基因等位基因；之后的研究便把BMPR-IB基因作為高繁殖力基因FecB基因的候選基因。

王根林等[6]利用“forced”限制性酶切片段長度多態性PCR技術首次發現湖羊和小尾寒羊存在FecB基因,基于這兩綿羊品種產羔率高,分別為228.92%和270%,所以認為FecB基因是控制它們多胎性狀的重要基因。王啟貴等[7]以綿羊BMPR-IB基因為候選基因,檢測湖羊、中國美利奴羊單胎和多胎品系中該基因的多態性,結果在不同品系羊中產生3種基因型(BB、B+和++),湖羊以BB基因型為主,中國美利奴羊單胎品系以++基因型為主,多胎品系以B+基因型為主；BB和B+基因型的母羊產羔數明顯較++基因型的母羊多。BMPR-IB基因在綿羊各品系間的分布和不同基因型綿羊的實際產羔情況表明：BMPR-IB為影響綿羊的產羔數的主效基因,可以用于對綿羊產羔數的選擇。其他學者[8-12]的研究均發現小尾寒羊、湖羊和中國美利奴羊多胎品系存在Q249R(A746G)突變,并且小尾寒羊以BB型基因為主,湖羊幾乎全為BB型基因,中國美利奴羊多胎品系以B+基因型為主,B基因與這3個綿羊品種的產羔數呈正相關,也認為BMPR-IB基因是控制這些綿羊高繁殖力的主效基因。

管峰等[13]的研究發現湖羊全部為BMPR-IB基因的突變純合體(BB),但并不認為該基因是控制湖羊多胎性能的主效基因；經選育后湖羊的產羔率顯著提高,說明BMPR-IB基因突變并不是影響湖羊品種內產羔率差異的主要因素,湖羊產羔率的差異還可能受其它因素或基因的影響,因此湖羊多胎性狀的分子機制還需進一步研究。

鐘發剛等[14]對中國美利奴羊多胎品系(新疆型)綿羊群體中BMPR-IB基因多態性分布與情期排卵數的研究發現,該群體中BB、B+基因型的情期排卵數平均為4.0個和3.5個,中國美利奴羊單胎群體母羊情期排卵數平均為1.56個,BB、B+基因型比++基因型的母羊分別多排卵2.44個(P＜0.01)和1.94個(P＜0.01),表明該基因具有明顯增加排卵數的作用,進一步確定BMPR-IB基因是影響中國美利奴羊多胎品系高產的主效基因,可以用于產羔數的標記選擇。但陳勇等[15]研究發現中國美利奴羊(新疆型)多胎品系的B+基因型與++基因型母羊的平均窩產羔數并無顯著差異,并認為B等位基因與中國美利奴羊(新疆型)多胎品系的多胎性無關,BMPR-IB基因分析方法不宜用于該品系多羔羊群的選育。

陳曉軍等[16]、史洪才等[17]和鐘發剛等[18]以多浪羊為研究對象均發現其存在BMPR-IB基因(A746G)的突變個體,但以++基因型為主,B+基因型的頻率分別為0.050 8、0.350和0.039；柳廣斌[19]首次在多浪羊中檢測到突變純合子,B+基因型的頻率為0.167。陳曉軍、史洪才和柳廣斌認為多浪羊的多胎性能與BMPR-IB基因存在極為密切的遺傳連鎖關系,很可能與Booroola羊遺傳機制相同；但鐘發剛認為多浪羊并非是一個多胎綿羊品種,其高產性能主要是由于該品種四季發情,而出現一年四季產羔。

1.2 FecX基因

Davis等[20]在多胎品種 Romney羊的 Inverdale和Hanna家系中X染色體上分別發現存在突變位點FecXI和FecXH,用攜帶FecXI基因的公羊(IY)與雜合子母羊(I+)交配,獲得純合子個體(II),結果II個體出現條斑卵巢且不育。Inverdale和Hanna是2個獨立的家系,但將 FecXI和 FecXH雜交得到的FecXIFecXH羊表現出與FecXIFecXI羊相同的表型特征,即具有條斑卵巢且不育[21]。骨形態發生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)是轉化生長因子β的超家族成員,在卵巢中特異性表達已定位在人X染色體Xq11.2上,FecXI和FecXH攜帶者的BMP15均發現有突變,但BMP15與FecX位點之間無重組現象,故BMP15可作為FecX位點的候選基因。

FecXH攜帶者的BMP15編碼區的第67個堿基由C突變成T,使第23個氨基酸殘基處的谷氨酸變成終止密碼子,編碼肽鏈提前終止,導致FecXH純合子個體的BMP15完全失去生物學功能；FecXI攜帶者在第92個堿基處發生突變(T→A),導致在高度保守蛋白質區內的第31個氨基酸殘基由纈氨酸替換成天冬氨酸,阻斷了BMP15形成二聚體,從而使FecXI純合子母羊的BMP15的生物活性受到干擾而使FecX純合子表現為不育；FecX雜合子母羊的BMP15基因中有一個拷貝失活,導致腔卵泡中的顆粒細胞對LH濃度的敏感性增強,從而增加排卵率[22]。

Hanrahan等[23]研究BMP15基因對Belclare綿羊和Cambridge綿羊高繁殖力影響時,發現 BMP15基因編碼區718處堿基突變(C→T)使肽鏈編碼區239位氨基酸由谷氨酰胺變成了終止子,即FecXG突變又稱B2突變,該突變可能導致了BMP15功能徹底喪失；Belclare綿羊的BMP15基因編碼區1 100處的堿基突變(G→T),導致了編碼區367號氨基酸殘基絲氨酸改變為異亮氨酸,即FecXB突變又稱B4突變,對綿羊高繁殖力影響顯著；BMP15基因核苷酸28～30位的堿基CT T缺失,導致編碼區10號氨基酸殘基亮氨酸缺失,形成B1突變體,該突變沒有改變BMP15的功能；BMP15基因核苷酸747位的堿基T突變為C,未引起249號氨基酸殘基脯氨酸的改變,形成B3突變體,該突變也沒有改變BMP15的功能。Belclare綿羊的B2突變純合子和B4突變純合子都是不育的,B2和B4兩者同時突變形成的雜合子(B2B4)也是不育的；Cambridge綿羊的B2突變純合子也是不育的；當BMP15基因突變為雜合子時,Belclare綿羊和Cambridge綿羊排卵數都增加。

柳淑芳等[8]、管峰等[13]和王啟貴等[24]分別研究小尾寒羊、湖羊和中國美利奴羊多胎品系群體中BMP15基因的FecXI和FecXH突變位點,結果都沒有在相應綿羊群體中發現這兩個突變位點存在多態性,從而排除了這兩個突變影響排卵數的可能性。白杰等[25]和柳廣斌[19]檢測多浪羊BMP15基因的FecXI、FecXH、FecXG和 FecXB四個突變位點,結果也沒有檢測到相應的突變,推測其多胎機制與BMP15基因無關。

楊晶等[26]根據綿羊BMP15基因全序列設計6對引物覆蓋全部的外顯子,結果只有1對引物在小尾寒羊上具有多態性,測序結果表明：AB基因型和AA基因型相比在cDNA第28 bp處缺失了3個堿基(CT T)也即是B1突變,平均產羔數多0.20只,差異不顯著(P＞0.05),說明BMP15基因的B1突變對其高繁殖力沒有顯著影響。儲明星等[27]發現湖羊和小尾寒羊中都沒有BMP15基因的B4突變(G→T),湖羊中也沒有B2突變(C→T),但在小尾寒羊BMP15基因編碼序列第718位堿基處發生了B2突變,同時存在突變雜合基因型(AB)和野生純合基因型(AA)兩種基因型,且AB基因型比AA基因型平均產羔數多0.62只(P＜0.01),說明BMP15 B2突變對小尾寒羊高繁殖力的影響十分顯著。

1.3 FecGH基因

FecGH突變又稱 G8突變,是生長分化因子 9(grow th differentiation factor 9,GDF9)基因編碼區第2外顯子1 184bp處發生C→T轉換后,使成熟肽鏈第77位氨基酸發生絲氨酸到苯丙氨酸的轉換,該基因是位于5號染色體上的常染色體基因[28],對早期卵泡的生長和分化起到重要調節作用。Hanrahan等[23]研究發現Belclare綿羊和Cambridge綿羊除BMP15突變外還存在一個GDF9突變,并且2種突變表型相似,雜合母羊排卵率增加,純合母羊卵母細胞可發育到正常大小,但卵巢表面呈“斑紋”狀,上皮顆粒脫落,有絲分裂不能完成,并且卵泡周圍的顆粒細胞表現異常狀態,最終導致不育。

以GDF9基因為高繁殖力候選基因,柳廣斌[19]和白杰等[25]對多浪羊以及儲明星等[27]對小尾寒羊和湖羊進行相關研究,結果均沒有檢測到GDF9基因的G8(C→T)突變；排除了GDF9基因突變影響多浪羊、小尾寒羊和湖羊高繁殖力的可能性。

李碧俠等[29]根據綿羊GDF9基因全序列,在外顯子1和外顯子2處各設計1對引物,分析其在小尾寒羊、湖羊、陶賽特羊和薩福克羊4個綿羊品種的多態性。引物1存在3種基因型即AA、AB和BB,小尾寒羊只有AA基因型,湖羊和多賽特羊有AA和AB兩種基因型,只有薩福克羊存在3種基因型；測序結果顯示BB型與AA型相比在cDNA第152處發生了單堿基的改變(A→G),并導致了氨基酸的改變(天冬酰胺→天冬氨酸)。引物2只有AA和AB兩種基因型,小尾寒羊只有AA基因型,其它品種均有兩種基因型。對兩對引物擴增片段的多態性分析發現：高繁殖力的小尾寒羊和湖羊的AB基因型頻率明顯低于低繁殖力的薩福克羊和陶賽特羊AB基因型頻率,可能AB型與綿羊高繁殖力存在一定的負相關。

2 高繁殖力基因的利用

2.1 用于群體的提純

隨著高繁殖力候選基因的確定和分子生物技術在遺傳學上的應用,使得品種的提純進程大大加快。目前的研究大多認為FecB基因是控制小尾寒羊和湖羊高繁殖力的主效基因,據此儲明星[30]提出對小尾寒羊和湖羊FecB基因進行檢測,將基因純合的BB型母羊和公羊集中在一起,這樣擴繁產生的后代全部是BB型小尾寒羊和湖羊,從而建立小尾寒羊和湖羊超高繁殖力核心群,為培育超高繁殖力綿羊新品種提供物質基礎。

FecB基因是由于常染色體上的正常基因突變而引起的,在我國的一些地方品種中也發現該突變。如新疆的多浪羊,已被證明[16-17,19]該突變可能是控制其多胎的主效基因,只是B基因頻率較低,因此可以通過檢測FecB基因,再采用同質選配,逐步提高群體中B基因頻率,進而把多胎性能主效基因固定下來；從而使地方品種固有的優良特性在得到保護的情況下建立高繁殖力的核心群。

2.2 用于雜交改良,培育新多胎品系

由于綿羊繁殖性狀為低遺傳力(0.10左右)性狀,常規遺傳改良耗時較長,進展太慢,阻礙了我國綿羊生產能力提高的進程。從遺傳育種角度來看,最經濟有效的方法是利用控制多胎性能的主效基因,或利用與控制多胎性能的數量性狀(QTL)相連鎖的標記進行輔助選擇或導入以提高綿羊的平均產羔數。因此,引進多胎品種改良本地綿羊再對其雜種后代進行橫交固定和擴繁,可培育新的多胎品系。

紫泥泉種羊場[31]1981年挑選具備中國美利奴羊(軍墾型A品系)品種特征、本身雙羔以上或連產雙羔以上個體組成基礎群,導入湖羊血液；然后采用回交,再采用適當的近交手段固定多胎性狀,經多年選育形成了具有高繁殖力、高泌乳量和優良羊毛品質等優點的中國美利奴羊(新疆軍墾型)多胎品系。鞏乃斯種羊場從1988年開始在新疆畜牧科學院的專家指導下,引入湖羊公羊同中國美利奴羊(新疆型)二、三級母羊進行雜交試驗,也培育出了多胎類型細毛羊。

2.3 用于經濟雜交

隨著羊肉特別是羔羊肉需求的增加,利用多胎綿羊開展經濟雜交生產肉羊和羔羊顯得尤為重要。經濟雜交一般采用三元雜交或雙雜交模式,首先是利用高繁殖力綿羊(如Booroola、小尾寒羊和湖羊等)與其它品種雜交,獲得含FecB基因的雜種母羊(產羔率高、性成熟早、泌乳力強),再用生長速度快的終端父本雜交生產肥羔。劉金祥等[32]采用無角陶賽特、小尾寒羊和灘羊進行三元雜交,結果表明：無角陶賽特羊×小尾寒羊×灘羊三元雜交羔羊的初生重、繁殖成活率、6月齡體重分別比小尾寒羊×灘羊二元雜交羔羊提高12.58%、10.73%、28.58%；既發揮了當地灘羊耐粗飼、適應當地自然氣候條件的特點,同時小尾寒羊多胎率及四季發情的特點也得到體現,又改進了二元雜交羔羊體軀不豐滿和產肉量低的缺陷。王元興等[33]以國外優良的肉用公羊為父本,湖羊為母本進行雜交,其產羔率達231.68%,與湖羊純繁產羔率251.25%相比差異不明顯(P＞0.05),雜交一代母羊的產羔率為181.82%,與外種羊純繁的產羔率158.33%相比有所提高,但相對于湖羊的產羔率有明顯下降,并認為產羔率主要取決于母羊的排卵數。湖羊在當地能耐最高氣溫37～39℃,全年相對濕度80%左右,這是其它綿羊所不及的。因此湖羊適于南方各省飼養,是推廣肉羊生產特別是利用雜種優勢生產肥羔的優良品種。

2.4 用于雜交后代繁殖力的評定

高繁殖力候選基因不但可以用于多胎品種的提純,而且可用于對雜交后代繁殖力的評定。于佐卿等[34]以綿羊GDF9和FecB基因為候選基因,研究德灘寒雜種羊和陶灘寒雜種羊(均含有小尾寒羊血液)的基因多態性及其對產羔數的影響,結果表明兩種基因在兩種雜交綿羊群體中各有2種基因型,分析發現GDF9基因的雜合子與兩種雜種綿羊的產羔數之間呈顯著負相關；FecB基因雜合子與陶灘寒雜種羊產羔數之間呈顯著正相關。

王公金等[35]選擇BMPR-IB作為侯選基因,研究該基因在杜泊綿羊、湖羊、小尾寒羊及杜湖、杜寒雜交F1代群體中的多態性分布規律。結果發現：小尾寒羊和湖羊普遍存在2種基因型BB和B+,而杜泊綿羊只有1種基因型++,杜寒雜交和杜湖雜交后代的基因型為BB和B+,并且雜交后代的基因型頻率與杜泊綿羊的基因型頻率差異極顯著(P＜0.01),可以看出杜泊綿羊與多胎綿羊品種湖羊和小尾寒羊雜交后代羊群繁殖性能的遺傳性狀得到了有效改善,因此BMPRIB分子標記可作為一種新穎的輔助技術用于評估杜泊綿羊與湖羊或小尾寒羊雜交后代的繁殖力。

對于一些含有FecB基因突變但基因頻率比較低的綿羊,或是對FecB基因是否為其多胎主效基因不確定時,可用該品種與繁殖率低(只有++基因型)綿羊雜交,測定含有FecB基因的F1代的繁殖力,如果F1代多胎性狀明顯,則可以確定FecB基因為該品種的多胎主效基因。對雜交后代繁殖力的測定既可用于該品種的提純也可用于雜交后代表觀繁殖性能等性狀的鑒定與比較,淘汰雜交后代中野生基因型個體,選擇突變基因型個體進行世代橫交固定,以便培育出高繁殖性能的肉用綿羊新品種(系)。

3 展望

目前國內的研究大多是檢測某個品種或品系有沒有相應已檢測出的多胎基因,對多胎基因驗證研究做的不多,于是在一些問題上存在著分歧,如：管峰等[13]認為BMPR-IB基因突變并不是影響湖羊品種內產羔率差異的主要因素；陳勇等[15]認為BMPR-IB的B等位基因與中國美利奴羊(新疆型)多胎品系的多胎性無關,BMPR-IB基因分析方法不宜用于該品系多羔羊群的選育；鐘發剛等[18]認為多浪羊并非是一個多胎綿羊品種。因此對已檢測出的多胎基因有必要進行驗證,比如通過測定高繁殖力綿羊與低繁殖力綿羊的雜交后代的繁殖力,看其含有多胎基因(如FecB基因)的F1代繁殖力的高低,進而確定這些品種的BMPRIB基因是否為其主效基因,也可以研究多胎基因的遺傳情況以及在不同世代中的傳遞規律；同時測定多胎綿羊的其它候選基因,看這些基因之間是否具有協同效應。

世界上生產性能比較高的綿羊品種,基本上都不是單一血統,大多是通過雜交再經過長期的選擇和培育而形成的。因此通過對具有高繁殖力性能綿羊的研究,有目的的利用雜交手段,對雜交后代進行選育和橫交固定可培育出新的品種或品系；也可以利用高繁殖力綿羊品種與低繁殖力綿羊品種之間的雜交,以提高雜交后代的生產性能進而增加養殖綿羊的經濟效益；但同時也要注意保護地方品種的優良特性。

另外多胎羔羊適合于舍飼,粗放的放牧形式使得母羊的產奶量不高,再加上環境等因素的影響則不利于羔羊的成活。因此在選用不同多胎品種進行雜交的時候,需要結合當地的情況,考慮到氣候條件、生產力狀況和飼養水平等以便選擇用于雜交的綿羊所產生的后代能夠較好的適應當地的情況。

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