環孢素A對大鼠急性腦缺血再灌注損傷小膠質細胞的活化及iNOS表達的影響

杜家琇 婁季宇 白宏英 曾志磊 楊霄鵬 王金蘭

鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州 450014

研究證實，免疫炎癥反應在缺血性腦損傷中發揮重要作用［1］，小膠質細胞（microglia，MG）是神經－免疫－內分泌系統的核心細胞，在中樞神經系統的免疫應答中發揮關鍵作用，和多種神經系統疾病的病理過程有關［2］，腦缺血后小膠質細胞大量表達、釋放和（或）分泌多種神經毒性物質、炎性因子和酶導致繼發性腦損害，其中iNOS是小膠質細胞影響腦缺血損傷進展的關鍵因素，其細胞定位以小膠質細胞為主［3］，由iNOS造成NO的過度釋放，產生細胞毒性作用。因此，減少腦缺血再灌注MG的激活，可以起到神經保護作用［4］。抑制MG活化或減少其產生的神經毒性物質將是治療腦缺血的新思路。環孢素A（cyclosporin A，CsA）是一種抗器官移植排斥反應的特效藥物，近年來發現CsA可以降低小膠質細胞活性，有神經保護作用［5］，但在大鼠腦缺血－再灌注損傷方面的研究較少。本實驗主要通過環孢素A干預小膠質細胞的活化及免疫炎性反應以減少病理損害，為臨床治療腦缺血性疾病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇 健康SD大鼠72只，清潔級，雌雄不限，體質量（240±30）g，由鄭州大學動物實驗中心提供。

1.2 分組、給藥方法 隨機將大鼠分為假手術組、模型組、環孢素A組，每組24只，各亞組均為6只，干預組從手術后2h到手術后2周，每天腹腔注射環孢素A（20mg／kg），模型組和假手術組注射等體積的生理鹽水。

1.3 腦缺血－再灌注模型的制備 參照Longa等報道的線栓法［6］并加以改進，制備局灶性腦缺血－再灌注模型（MCAO），栓線長45mm，線身直徑0.26mm，線頭直徑0.34mm，距頭端20mm做標記，術前12h大鼠禁食不禁水，模型組及環孢素A組均進行左側大腦中動脈栓塞。栓線插入深度18～22mm，缺血120min時，拔出栓線約10mm，進行再灌注。假手術組僅分離頸總動脈。

1.4 模型動物神經功能缺陷評分標準及選擇 神經功能缺陷評分按照Zea Longa 5分制評分標準［6］，0分：無神經系統功能缺失；1分：輕度局灶性神經功能缺失；2分：中度局灶性神經功能缺失（爬行時向癱瘓側轉圈）；3分：中度局灶性神經功能缺失（行走時向癱瘓側傾倒）；4分：不能自發行走，有意識障礙。1～3分的動物模型為入選標準。

1.5 OX－42、iNOS免疫組織化學染色 各相關時間點大鼠在麻醉后經左心室灌注，即切開胸骨，經心臟灌注生理鹽水，繼用4%的多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，浸入固定液中過夜，脫水、透明、浸蠟，冠狀位連續冰凍切片，片厚為4μm。免疫組織化學染色（SP），顯微鏡下觀察OX－42、iNOS表達情況。

1.6 圖像采集分析 采用德國Lecia顯微照相系統采集圖片，Biosens Digital Imaging System v1.6分析系統對 OX－42及iNOS的表達進行定量分析。每個標本隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下的陽性區平均灰度值，以5個視野的平均灰度值的平均值作為該例的測量值。

1.7 統計學處理 采用SPSS12.0統計軟件處理，實驗數據用均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，α＝0.05為顯著性檢驗性水準。

2 試驗結果

2.1 神經行為學評分 大鼠局灶腦缺血／再灌注后各組神經行為學評分結果見表1。

表1 大鼠神經行為學評分 （）

表1 大鼠神經行為學評分 （）

注：與模型組比較，★P＜0.05

組別 n 1d 3d 7d 14d假手術組 24 0 0 0 0模型組 24 2.39±0.56 2.25±0.25 2.05±0.45 2.12±0.49環孢素 A組 24 2.20±0.35★ 1.93±0.72★ 1.82±0.13★ 1.88±0.13★

2.2 海馬一區OX－42免疫組化檢測分析 見表2。假手術組可見少許OX－42陽性表達的小膠質細胞，模型組1d即有OX－42的大量表達，3d時達峰，7d下降但仍高于正常，14d時接近正常，環孢素組較模型組表達減少，經統計學處理有顯著性差異。

表2 3組各相應時間點海馬CA1區OX－42陽性區平均灰度值 （）

表2 3組各相應時間點海馬CA1區OX－42陽性區平均灰度值 （）

注：與假手術組比較，★P＜0.05，●P＞0.05；與模型組比較，△P＜0.05，□P＞0.05

組別 n 1d 3d 7d 14d假手術組 24 105.03±5.37 108.42±8.96 103.17±7.73 106.54±9.27模型組 24 135.60±5.11★ 154.97±4.62★ 125.31±4.32★ 105.31±3.15●環孢素 A組 24 122.92±3.46★△ 134.49±4.45★△ 113.82±5.80★△ 106.14±3.90●□

2.3 海馬一區iNOS免疫組化檢測分析 見表3。假手術組海馬一區未見iNOS陽性表達，模型組1d時iNOS表達最高，3d時下降但仍高于正常，7d時接近正常，環孢素組較模型組表達減少，經統計學處理有顯著性差異。

表3 3組各相應時間點海馬CA1區iNOS陽性區平均灰度值 （）

表3 3組各相應時間點海馬CA1區iNOS陽性區平均灰度值 （）

注：與假手術組比較，★P＜0.05，●P＞0.05；與模型組比較，△P＜0.05，□P＞0.05

組別 n 1d 3d 7d 14d假手術組 24 101.11±4.69 100.16±5.36 102.54±6.39 106.84±3.02模型組 24 148.69±5.09★ 126.32±6.65★ 105.37±4.12● 106.49±5.08●環孢素 A組 24 131.94±4.05★△ 115.19±5.75★△ 106.17±4.06●□ 103.94±3.44●□

3 討論

缺血性腦血管病在腦卒中的發生率高達80%，無特效治療方法。近年來，隨著分子生物學、免疫學、病理學以及神經影像學等基礎研究技術的發展，對其發病機制有了進一步的認識。腦缺血再灌注損傷總是伴隨著免疫應答和炎癥反應，這個過程中小膠質細胞起了關鍵作用，小膠質細胞是腦內重要、最活躍的免疫炎癥細胞，調控小膠質細胞活化可能是干預缺血性腦損傷的方法之一，小膠質細胞在神經元損傷中的重要性將會是以后研究的重點［7］。本實驗顯示，急性腦缺血再灌注損傷后，大鼠海馬一區小膠質細胞過度表達，較對照組明顯減少（P＜0.05），應用環孢素A后，隨著OX－42的減少，其神經行為學評分優于模型組，顯示了小膠質細胞數量的增加與神經元受損程度相一致，與再灌后腦損傷的程度可能成正相關。

激活后的MG一方面與神經細胞直接接觸，發揮直接的毒性作用，另一方面產生一系列細胞因子和神經毒性物質，和中樞神經系統免疫炎癥級聯反應關系十分密切，其中研究最多的是NOS，NOS分為神經元型一氧化氮合酶（nNOS）、內皮細胞型一氧化氮合酶（eNOS）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）3種亞型，iNOS主要由 MG在一定的環境條件下產。Ladecola C等［8］研究發現iNOS利用精氨酸、氧氣和NADHP產生NO，是腦缺血再灌后損傷過程中的關鍵因素。我們試驗結果表明，iNOS在腦缺血再灌后損傷過程中大量表達，其表達的程度和神經功能障礙的程度相一致。

環孢素A是一種特效的免疫抑制劑，近來研究發現環孢素A對腦缺血－再灌注損傷具有腦保護作用。研究表明其腦保護作用機制主要有幾個方面：（1）抑制鈣調神經磷酸酶（CaN）活性；（2）封閉線粒體通透性轉換孔（MPTP），維持線粒體結構和功能；（3）降低小膠質細胞表達及活性。然而對于小膠質細胞方面研究很少，本實驗主要從這方面入手，結果顯示環孢素A組大鼠海馬CA1區小膠質細胞及iNOS的表達較對照組明顯減少（P＜0.05），神經行為學評分優于模型組，顯示了環孢素A的神經保護作用在于抑制小膠質細胞和iNOS的活性。

資料表明，環孢素有諸多不良反應。在我們實驗中，由于應用療程短，未發現明顯的不良反應，其治療的安全性和有效性有待進一步深入研究。

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