P33ING1、p53基因在膀胱移行細胞癌中的表達及其意義

楊承綱 胡早秀 陳 蕓

膀胱癌是泌尿生殖系統中最常見的惡性腫瘤，其中90% 以上是膀胱移行細胞癌(bladder transitional cell carcinoma，BTCC)。Garkavtsev等[1]采用在消減cDNA雜交(substractive hybridization)的基礎上，結合GSE(genetic suppressor element)方法，克隆出1個新基因命名為inhibitor of growth 1(ING1)，ING1基因的主要蛋白翻譯產物為P33ING1 蛋白。近年研究資料表明ING1是1個腫瘤抑制基因，參與細胞生長抑制、衰老、凋亡； P33ING1蛋白常被人們稱為p53基因的“分子伴侶”，其對細胞生長的抑制作用是通過提高p53依賴的P21/waf1的功能，使細胞周期阻滯在G1期來發揮作用。本實驗采用鏈霉素抗生物蛋白-過氧化酶免疫組化染色(SP)法，檢測P33ING1與p53基因在膀胱移行細胞癌中的表達，并探討P33ING1、p53基因的相關關系及其表達在膀胱移行細胞癌中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集云南省腫瘤醫院病理科2000年～2007年收治的83例膀胱移行細胞癌及11例正常膀胱黏膜組織，83例BTCC中，男性63例，女性20例，年齡35～84歲，平均年齡59.5歲。行病理檢查前均未接受過放療和化療，術后均行化療藥物膀胱灌注治療。按WHO病理組織學分級標準，G129例，G231例，G323例；Tis～T1期(淺表性腫瘤)51例，T2～T4期(浸潤性腫瘤)32例。所有標本均經10%福爾馬林液固定、石蠟包埋，4 μm厚連續切片。術后隨訪16個月～5年，平均38個月，失訪5例，腫瘤復發或轉移56例，死亡2例，無復發或轉移20例。

1.2 方法

羊抗人P33ING1 單克隆抗體為Santa Cruz Biotechnology公司產品，抗體稀釋度為1∶50，p53單抗、SP染色試劑盒、DAB顯色劑、抗體稀釋液購自福州邁新公司。采用S-P法進性免疫組化染色，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

結果判定： p53以細胞核染色呈棕黃色顆粒為陽性；P33ING1大部分陽性定位于細胞核，少部分陽性定位于細胞質，陽性染色呈棕黃色顆粒。結果判定參照文獻報道[2]，每例在光鏡下(400 ×)計數腫瘤細胞中陽性細胞百分比。陽性細胞數<10%為陰性，陽性細胞數≥10%為陽性。

1.3 統計學方法

2 結果

83例膀胱移行細胞癌中，42例(50.6%)p53表達陽性，49例(59.03%) P33ING1表達陽性。

P33ING1蛋白表達水平膀胱移行細胞癌 G1、G2與G3比較有顯著性差異(P<0.05)，G1與G2比較其表達無顯著性差異(P>0.05)；p53蛋白表達膀胱移行細胞癌G1與G2、G3比較有顯著性差異(P<0.05)，G2與G3比較其表達無顯著性差異(P>0.05)。P33ING1及p53蛋白表達Tis～T1與T2～T4比較有顯著性差異(P<0.05)。隨訪5年發現復發死亡組p53蛋白表達率顯著高于無復發組；復發死亡組P33ING1蛋白表達率顯著低于無復發組。相關分析發現，P33ING1蛋白表達與膀胱移行細胞癌病理分級及臨床分期呈負相關關系(γ=-0.263，P=0.016；γ=-0.388，P=0.001)；p53蛋白表達與其病理分級及臨床分期呈正相關關系(γ=0.492，P=0.001；γ=0.341，P=0.002)； P33ING1 蛋白表達與p53表達呈顯著正相關關系(γ=0.352，P=0.008 )，見表1。

3 討論

ING1 基因是1種重要的抑癌基因，定位于人類染色體13q33-34，由外顯子1a和外顯子2轉錄翻譯出的P33ING1蛋白是ING1基因的主要蛋白翻譯產物 。體外實驗發現，P33ING1表達降低可使細胞生長加快，而過表達可抑制細胞生長，促進細胞凋亡，對細胞周期起負調控作用[3]。其與p53有相互依賴作用，參與p53介導的多種轉錄調控活動，能抑制細胞生長、誘導細胞凋亡及促進損傷修復。其低表達則可刺激克隆形成，促使細胞惡性轉化，導致腫瘤發生[4]。Helbing等[5]通過無血清培養的細胞死亡敏感試驗，證實P33ING1 有促細胞凋亡的作用。Oki等[6]證實P33ING1 與p53基因是相互協同、相互依賴的方式，通過激活p21/WAF1的轉錄來對細胞生長起負反饋調節作用，兩者一起表達才能起抑制細胞增殖，認為P33ING1 的異常表達阻止了p53促進細胞凋亡，從而形成了腫瘤。同樣，p53不是單獨發揮抑癌作用，它需要P33ING1蛋白的協同作用，共同抑制腫瘤的發生。有研究報道P33ING1蛋白在人的頭頸部鱗癌、胃癌、結腸癌及乳腺癌中均有ING1基因表達下降[7]。本研究中發現，P33ING1表達在正常對照組中陽性表達率為90.90% ，而在膀胱移行細胞癌中陽性率為50.3%，表達強度明顯降低，差別顯著，與以上文獻報道的一致，表明P33ING1失表達在膀胱癌的發生發展中可能起重要作用。

表1 P33ING1、p53蛋白表達與膀胱移行細胞癌臨床病理及預后的關系(例，%)

Garkavtsev等[1]發現人成纖維細胞株中，減弱P33ING1 的表達能抑制p53調控細胞生長的功能，P33ING1 是p53蛋白發揮正常功能所必需的。單獨p53基因或P33ING1 基因導致的細胞凋亡及G0/G1期阻滯要弱于兩基因同時發揮功能時的狀態。祝峙等[8]采用脂質體方法，將P33ING1與wtp53基因分別轉染人HepG2、PLC/PRF/5和HeP3B三株內源性p53基因表達狀態各不相同的肝癌細胞株，以探討P33ING1與p53基因間的協同功能對肝癌細胞生長、阻滯細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡的影響，結果發現：在表達內源性wtp53的HepG2細胞中導入外源性P33ING1基因，使P33ING1 蛋白在HepG2細胞內過表達，Western印跡結果顯示在HepG2細胞內，隨著P33ING1 蛋白表達量升高，p53蛋白表達也增強。過表達P33ING1 使HepG2細胞凋亡率上升，G0/G1期細胞阻滯增多。本實驗結果為P33ING1 蛋白表達與p53表達呈現較明顯的正相關關系，與文獻報道的一致[9]。這提示，P33ING1與wtp53蛋白在核內的表達緊密相關，兩者要同時存在才能發揮正常功能，當它們其中的1個失活，另1個就不能單獨抑制細胞生長，這也進一步證實P33ING1與 p53基因的“分子伴侶”關系。

本實驗結果表明P33ING1蛋白表達膀胱移行細胞癌 G1、G2與G3比較差異有顯著性，G1與G2比較差異無顯著性；p53蛋白表達在膀胱移行細胞癌G1與G2、G3比較有顯著性差異，G2與G3比較無顯著性差異。P33ING1及 p53蛋白表達Tis～T1與T2～T4比較有顯著性差異。隨訪5年p53蛋白表達率復發死亡組顯著高于無復發組；P33ING1蛋白表達率復發死亡組顯著低于無復發組。相關分析發現，P33ING蛋白表達與膀胱移行細胞癌病理分級及臨床分期呈負相關；p53蛋白表達與其病理分級及臨床分期呈正相關。提示在膀胱癌中p53高表達P33ING低表達者的預后較差。鑒于野生型p53與P33ING1有相互協同及依賴關系，所以在腫瘤的形成、發展、早期診斷及基因介導治療方面，檢測p53的狀態和P33ING1水平的變化情況可能有重要的意義。同時檢測p53的狀態和P33ING1表達水平，對膀胱癌的診斷、治療和預后判斷可能具有積極意義。

[1] Garkavtsev I，Kazarov A，Gudkov A，et a1.Suppression of the novel growth inhibitor p33/INGI promotes neoplastic transformation〔J〕.Nature Genet，1996，14(4)：415.

[2] Ma D，Lawless D，Riabowo1.Suppression of the novel growth inhibitor p33 INGI promotes neoplastic transformation(correction)〔J〕.Nature Genet，1999，23(3)：273.

[3] Garkavtsev I，Riabowol K.Extension of the replicative life span of human diploid fibroblasts by inhibition of P33 INGI candidate tumor suppressor〔J〕.Mol Cell Bid，1997，17(4)：2014.

[4] 曾凡軍 ，周媛媛.p33ING1與非小細胞肺癌相關性的研究進展〔J〕.山東醫藥，2009，49(3)：113.

[5] Helbing CC，Veillette C，Riabowol K，et a1.A novel candidate tumor suppression P33/INGI is involved in the regulation of apoptosis〔J〕.Cancer Res，1997，57(7)：1255.

[6] Nouman GS，Angus B，Lunec J，et a1.Comparative assessment of expression of the inhibitor of growth 1 gene(INGI)in norm al and neoplastic tissues〔J〕.Hybridoma，2002，21(1)：1.

[7] Tokunage E，M aehara Y，Oki E，et al.Diminished exp ression of ING1mRNA and the correlation with p53 exp ression in breast cancers〔J〕.Cancer Lett，2000，152 (1):15222.

[8] 祝 峙，朱明華，倪燦榮.原發性肝細胞癌癌組織中P33INGIb與p53基因的表達〔J〕.中華醫學雜志，2002，82(19)：1332.

[9] 李啟忠，王向陽.P33ING1b在膀胱移行細胞癌中的表達及其意義〔J〕.國際外科學雜志，2007，34(6):376.