紫杉醇同步放化療對子宮內膜癌HEC-1A細胞系的抑制作用及其機理的初步研究

李 靜 孔為民 李麗英 牛聚偉 張衛華

子宮內膜癌特別是不能手術的中晚期(ⅢA～ⅣB期)子宮內膜癌患者的預后較差,因此，探討更有效的治療方法顯得尤為必要。本研究探討了順鉑或紫杉醇聯合放射線同步作用對子宮內膜癌HEC-1A細胞系的抑制情況及其可能機制，為進一步動物體內實驗和臨床試驗提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

子宮內膜癌HEC-1A細胞株系北京大學人民醫院婦產科實驗室惠贈。紫杉醇為注射液，為海口市制藥廠有限公司產品。細胞培養基為美國Invitrogen Corporation 公司生產的GIBCO品牌的 DMEM高糖培養基。胎牛血清由德國Biochrom公司生產的特級胎牛血清。胰蛋白酶購于北京鼎國生物技術有限公司。噻唑藍(MTT)由美國Amresco公司生產。RNA酶為美國Sigma 公司生產。碘化丙啶(PI)為美國Sigma 公司生產。酶聯免疫檢測儀系美國基因有限公司生產，型號ELX800。數字彩色圖像照相機由德國Leica公司制造，型號DFC300FX。流式細胞儀為Beckman-Coulter公司生產的Coulter Eplcs XL流式細胞儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人子宮內膜癌HEC-1A細胞株，培養于含10%胎牛血清、200 U/ml谷氨酰胺、100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養基中。用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取生長狀態穩定、呈對數生長期細胞用于實驗。實驗共分為6個組：對照組，紫杉醇IC10濃度組，紫杉醇IC50濃度組，單純放療組，紫杉醇IC10濃度+放療組，紫杉醇IC50濃度+放療組。

1.2.2 紫杉醇作用 24 h的10%藥物致死劑量(24 hIC10)及24 h的50%藥物致死劑量(24 h IC50)的選擇調整細胞濃度為5×104個/ml，以200μl/孔接種于96孔板，另設空白調零孔。于飽和濕度條件下5%CO237℃恒溫培養箱中培養24 h后，紫杉醇按照終濃度2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、12 μmol/L、16 μmol/L、20 μmol/L、24 μmol/L、28 μmol/L、32 μmol/L的濃度梯度，每孔加入各濃度化療藥物100 μl，每濃度設6個復孔，對照孔加入藥物溶劑(0.9%氯化鈉注射液)100μl。繼續培養24 h后,采用MTT法測各孔光吸收值(OD值)。實驗重復3次。

1.2.3 各組抑制率比較 消化離心HEC-1A 細胞，調整細胞濃度為5×104/ml，以200 μl/孔接種于96孔板，每組設6個復孔，另設空白調零孔。細胞培養24 h，加入相應濃度的化療藥物，另外放射線照射組加入相應濃度的化療藥物后立即行60Co射線照射，照射劑量為4 Gy。照射后繼續在培養箱中培養。每48更換培養基，同時重新加入相應濃度的化療藥物。分別于24 h、48 h、72 h、96 h于倒置顯微鏡下,用型號為DFC300FX的數字彩色圖像照相機，取每孔中心點視野拍攝細胞圖片，觀察細胞形態改變。 采用MTT法檢測各組OD值。實驗重復3次。

1.2.4 應用流式細胞技術比較各組細胞周期及細胞凋亡情況 將濃度為1×106/ml的細胞以2 ml/孔接種于6孔板，每組設3個復孔，另設對照孔。收集各處理組培養48 h的含藥培養基及PBS洗液，消化離心細胞，加入終濃度為70%的-20℃酒精，-20℃過夜固定，離心棄酒精，加1 ml RNA酶A(終濃度為100 μg/ml),置于37℃培養30 min，加0.1 ml碘化丙啶(PI)(終濃度為50 μg/ml)避光染色至少30 min,應用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡。

1.3 統計學處理

相對抑制率(%)=1-(實驗組OD值-空白調零組OD值)/(對照組OD值-空白調零組OD值)。應用SPSS13.0統計軟件包，概率分析法計算IC10值及IC50值，采用t檢驗比較各組的OD值及抑制率。應用EXPO32 ADC 1.1C統計軟件分析流式細胞儀檢測結果。

2 結果

2.1 紫杉醇對HEC-1A細胞作用24 h的IC10值及IC50值

應用MTT法檢測，采用SPSS概率法計算，紫杉醇對HEC-1A細胞系作用24 h后的IC10值及IC50值分別為5.87[95%可信區間(4.28，7.28)]及13.83[(95%可信區間(12.18，15.25)]。不同濃度梯度的紫杉醇作用于子宮內膜癌HEC-1A細胞株24 h后的OD值及抑制率見表1。不同濃度紫杉醇抑制率曲線見圖1。

表1 紫杉醇各濃度的OD值及抑制率

圖1 不同濃度紫杉醇抑制率曲線圖

2.2 各組細胞的形態學改變

肉眼見培養基顏色隨培養時間延長逐漸變黃。低倍(10×10倍)倒置顯微鏡下可見到經放化療作用后細胞逐漸出現皺縮、變圓、脫落。并隨用時間延長，被破壞的細胞增多。高倍(10×20倍)倒置顯微鏡下可見部分細胞體積改變，細胞內出現空泡，細胞結構破壞，裂解成碎片。

2.3 不同濃度紫杉醇及放療不同時間對HEC-1A細胞的抑制作用

單純放療組、紫杉醇IC10濃度+放療組、紫杉醇IC50濃度+放療組作用于HEC-1A細胞24 h、48 h、72 h、96 h OD值及抑制率見表2。

2.4 各組48細胞周期改變及凋亡情況

經流式細胞儀分析，對照組、紫杉醇IC10濃度組、紫杉醇IC50濃度組、單純放療組、紫杉醇IC10濃度+放療組和紫杉醇IC50濃度+放療組48 h S期和G2期細胞比例及凋亡細胞比例見表3。

3 討論

由于放射治療是對老年患者或合并有嚴重內科疾患不能接受手術治療或有手術禁忌證的子宮內膜癌患者的重要治療方法，而子宮內膜癌對放射線的敏感性又相對差于宮頸癌[1]，因此，對同步放化療能否提高放射線對子宮內膜癌細胞的抑制作用，從而提高不能手術的子宮內膜癌患者的治療效果的研究具有重要意義。

3.1 紫杉醇同步放化療對子宮內膜癌的抑制作用

經臨床研究發現，紫杉醇用于宮頸癌的同步放化療已初步證實具有良好療效[2]。紫杉醇作為1種新型的抗腫瘤藥，對各種進展期的人子宮內膜癌有緩解作用,在人子宮內膜癌的有效率最高可達80%[3]。目前僅有很少關于子宮內膜癌同步放化療(CRT)的臨床試驗研究。RTOG-9708試驗[4]研究證實對內膜癌患者放療同時予順鉑50 mg/m2，第1天，第28天的方案可行，其局部控制效果較好，放化療療效具有增加效果，但是仍發生遠處轉移，其遠期療效尚待進一步隨機試驗研究證實。Kelly等[5]的研究結果表明子宮內膜癌術后鉑類盆腔同步放化療,與術后傳統放療比較,ⅢC期以下癌,同步放化療優于傳統放療,ⅢC期及以上的晚期癌,同步放化療與傳統放療無差異。GOG-9907研究[6]報道順鉑(25 mg/m2)加紫杉醇(20 mg/m2)周療同時予全腹外照射方案可行，但是有中度的急性及慢性胃腸道反應。從以上幾個臨床試驗的初步結果可以看出，子宮內膜癌的同步放化療似乎有效，但其療效尚缺乏實驗研究的證據。本實驗研究結果表明小劑量(24 h IC10濃度)的紫杉醇能夠增加放射線對子宮內膜癌HEC-1A細胞的抑制作用；大劑量(24 h IC10濃度)的紫杉醇與放射線對子宮內膜癌HEC-1A細胞具有更強的抑制作用。研究結果從體外實驗角度證實了紫杉醇同步放化療對子宮內膜癌HEC-1A細胞系有協同抑制作用。

3.2 紫杉醇或順鉑同步放化療協同抑癌作用機理

本實驗提示小劑量紫杉醇與放射線的協同作用機制可能主要與其能夠使細胞周期停滯于G2期，從而增加細胞對放射線的敏感性有關。Randall等[7]的研究發現，紫杉醇對卵巢癌細胞的抑制作用與其能夠誘導凋亡相關。Carlos[8]報道，紫杉醇對前列腺癌的抑制作用主要是使細胞停滯于G2/M期，從而誘導細胞凋亡，與本實驗結論一致。本實驗研究發現，隨著紫杉醇劑量的增加，停滯于G2期的細胞比例增加，但是凋亡細胞比例沒有明顯增加，分析可能是由于本實驗檢測的為晚期凋亡細胞比例，不除外檢測時細胞還處于凋亡早中期，DNA還沒有從細胞內漏出，從而不能在檢測圖中體現出來。

表2 各組不同時間OD值及抑制率比較

表3 各組48 h S期和G2期細胞比例及凋亡細胞比例(%)

總之，目前，關于子宮內膜癌的同步放化療的國內外相關文獻報道較少，我們的體外實驗研究結果提示紫杉醇同步放化療對子宮內膜癌HEC-1A細胞具有協同抑制作用，其作用機理是小劑量或大劑量紫杉醇能夠使細胞周期停滯于G2期，使細胞對放射線的敏感性增加。其療效及作用機理尚待進一步體內實驗及臨床試驗研究證實。

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[3] Lane DP.A death in life of p53〔J〕.Nature,1993,362:786.

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[7] Randall K Gibb,Douglas D Taylor,Tina Wan,et al.Apoptosis as a measure of chemosensitivity to cisplatin and taxol therapy in ovarian cancer cell lines〔J〕.Gynecologic Oncology,1997,6(1):13.

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