浙江省9株豬鏈球菌2型分離株Cps2J全基因克隆與序列分析

姚蘋蘋,王復甦,朱函坪,梅玲玲,葉菊連,羅 進,張 政,姚晨輝

浙江省9株豬鏈球菌2型分離株Cps2J全基因克隆與序列分析

姚蘋蘋1,王復甦1,朱函坪1,梅玲玲1,葉菊連1,羅 進1,張 政1,姚晨輝2

目的 了解浙江豬鏈球菌2型(SS2)分離株的分子基礎及與國內外其他分離株的基因差異程度,確定Cps2J基因變異位點和頻率,為該地區的豬鏈球菌防治提供科學依據。方法提取菌株DNA,應用聚合酶鏈反應(PCR)擴增菌株Cps2J基因全片段,克隆入質粒載體,純化后采用AB I自動測序儀測定序列,并同國內外其他分離株的基因進行比較。結果擴增出9株菌株的Cps2J基因的完整開放閱讀框(ORF)都為999bp,編碼333個氨基酸,9株菌株Cps2J片段核苷酸高度同源,同源性在99.7%～100%;與國內外其他的SS2核苷酸的同源性為98.8%～99.0%,與豬鏈球菌1型的同源性只有56.8%～57.0%。結論9株浙江省豬鏈球菌2型分離株Cps2J基因序列非常保守,這些不同來源的菌株可能有相同的起源。

豬鏈球菌2型;Cps2J基因;序列分析

豬鏈球菌是引起豬鏈球菌病的病原,按莢膜多糖抗原(Cps)不同可將其分成35個血清型(1-34型及1/2型)及相當數量無法定型的菌株〔1-2〕,在所有的豬鏈球菌中,血清2型呈全球性分布,致病力強,是引起人、豬感染發病的重要人獸共患病病原〔3〕。在我國,1991年廣東省在國內首次報道了豬感染SS2疫情〔4〕,1998年江蘇南通地區豬群暴發SS2疫情,并在國內首次報道了人感染 SS2的病例〔5〕。浙江省自2005年開始對豬鏈球菌進行了監測和病原學的分離,近年本實驗室從疑似豬鏈球菌病人的血液或腦脊液中分離到10多株菌株,為了解浙江分離株的分子生物學特性,本研究選用了9株在2005-2008年從浙江省不同地區的疑似病人中分離的菌株,進行了Cps2J基因的克隆、測序,并與國內外豬鏈球菌Cps2J片段的基因序列作了比較分析,為進一步研究該地區豬鏈球菌的分子流行病學情況奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源 選用的9株SS2為 2005-2008年本實驗室分離自浙江省各地區的豬鏈球菌2型病人的血液和腦脊液。編號分別為 ZJWL2005、ZJJH2005、ZJTZ2005(2005年分離自溫嶺、金華和臺州)、ZJHZ2006、ZJW Z2006(2006年分離自湖州和溫州)、ZJNB2007、ZJSX2007(2007年分離自寧波和紹興)、ZJWZ2008、ZJJX2008(2008年分離自溫州和嘉興)。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司 ;克隆載體、T4連接酶、DNA Taq酶、聚合酶鏈反應(PCR)相關試劑、Agrose膠純化試劑盒及質粒DNA純化試劑盒購自日本 TA KARA中國分公司。

1.3 引物的設計與合成 參考豬鏈球菌2型SC22菌株Cp s2J基因核苷酸序列,自行設計并合成引物P1:5’-A TGGAAAAAGTCAGCA TTA TTG-3’,P2:5’-TTAA TCA TTA TTTTTTTCTTC-3’,引物由上海生物工程公司合成。

1.4 細菌培養和DNA提取 挑取血平板上的單菌落接種于 Todd-Hew itt肉湯培養基中,37℃振蕩培養過夜。取1.5 m L菌液離心,常規方法提取基因組 DNA〔6〕,溶于 TE中 ,置 -20 ℃備用。

1.5 PCR擴增 基因組DNA在引物P1和 P2進行PCR擴增,擴增的條件為95℃180s,94℃60s、55℃60s、72℃90s,30個循環,72℃延長10 min。1.6 PCR產物的克隆及篩選 用Agrose膠提取試劑盒提取 Cps2J基因的擴增片段,克隆入pMD19-T質粒載體,轉化 E.coli DH5a,涂布于含氨芐西林、X-gal和 IPTG的固體培養基平板上,藍白斑篩選重組菌,堿法提取質粒。

1.7 核苷酸序列測定和分析 核苷酸序列測定委托上海生物工程公司完成,利用AB I自動測序儀將帶有目的基因的質粒從正反兩個方向分別進行測序,將測定的序列結果應用DNA STAR軟件(Seq-M an)進行拼接,得到全長Cps2J基因的核苷酸序列,將拼接后的全基因序列用DNA STAR軟件進行核苷酸序列和所推導的氨基酸序列的同源性分析。用于比較分析的豬鏈球菌序列來自于 Gen-Bank。

2 結 果

2.1 PCR擴增和產物的克隆 用豬鏈球菌2型Cps2J引物 P1和 P2進行 PCR擴增,獲得999 bp大小的目的片段(圖1),與預計擴增片段的分子量基本一致。將目的片段克隆至pMD19-T載體,轉化 E.coli DH 5α宿主菌,結果轉化后白斑數達90%左右,陽性克隆率約80%左右,經 PCR鑒定證實了克隆的正確。

2.2 分離株Cps2J片段全長基因序列 9株菌株的Cps2J基因的完整開放閱讀框(ORF)都為999bp,編碼333個氨基酸。9株菌株的Cp s2J基因全序列均已在 GenBank上登錄,注冊號為GQ352502-GQ352510。

2.3 分離株Cps2J基因序列分析 9株浙江分離株Cp s2J片段核苷酸高度同源,同源性在99.7%～100%,氨基酸同源性在99.1%～99.7%;9株浙江株與廣東JM 0550株核苷酸同源性為99.3%～99.6%;與上海 1-3、031238、051237、guoguang、SH29株為99.5%～100%;與中國其它地區分離株98015、SC152、SC17、SC22、HA 0609、HA 0610、SS2-1、ZYS8為 98.8%～100%,與日本 CVCC607株為99.8%～100%;與荷蘭10株為98.9%～99.0%;與豬鏈球菌1型荷蘭6555株的同源性為56.8%～57.0%。這 9株分離株和中國株 SS2的 SC22、ZYS8及荷蘭株10 Cp s2J基因核苷酸和氨基酸序列的差異見表1。

圖1 9株SS2浙江分離株Cps2J片段PCR擴增條帶Fig.1 Amplified product of Cps2J fragment of 9 strains SS2 from Zhejiang province M:100bp DNA marker,1-9:9 strains SS2 gene amp lified by PCR

3 討 論

本研究的9株SS2浙江分離株分別為2005-2008年分離自浙江各地區的菌株,從研究結果看,9株浙江分離株SS2 Cps2J片段核苷酸及氨基酸同源性達到99.7%～100%和99.1%～99.7%;與中國上海株、廣東株及中國其他地區分離株的同源性也高達98.8%以上;與國外日本、荷蘭株的同源性在98.9%以上;相對與中國株ZYS8和荷蘭株10的核苷酸及氨基酸的突變位點較多,與 ZYS8株和荷蘭10株核苷酸及氨基酸同源性為98.8%～99.0%和97.9%～98.2%,與豬鏈球菌1型荷蘭6555株的同源性在56.8%～57.0%,證明9株浙江豬鏈球菌分離株均為2型,Cp s2J的基因序列極為保守,表明浙江地區不同時空SS2菌株Cps2J沒有顯著差異。9株浙江分離株均分離自豬鏈球菌疑似病人的血液和腦脊液,通過與 GenBank上明確宿主為豬的菌株序列比較,同源性在98.8%～100%,說明這些不同來源的菌株可能有相同的起源。

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莢膜多糖的抗原性不同是豬鏈球菌血清分型的依據,莢膜多糖能保護細菌在免疫動物體內不被吞噬,決定豬鏈球菌侵襲力,最近 Charland等制備了2株莢膜多糖缺失的變異株,證實了莢膜多糖對2型菌株是一種非常重要的致病因子〔7〕。豬鏈球菌 2型Cps全長 15 401 bp,有 14個開放 閱讀框,即Cps2Z,Cps2Y,Cps2X,Cps2A,Cps2B,Cps2C,Cps2D,Cps2E,Cps2F,Cps2G,Cps2H,Cps2I,Cp s2J和Cp s2K。Cp s2J位于莢膜基因組的13 583 bp至14 579 bp之間,全長996 bp,在豬鏈球菌 35個血型中,Cps2J與1/2型有較高的同源性外,與其他33個血清型的序列同源性都很低,目前Cps是國內外利用PCR技術鑒別診斷豬鏈球菌2型設計引物的主要基因組〔8〕,本次通過對浙江 9株 SS2 Cps2J的序列測定與分析,為建立適合于浙江豬鏈球菌莢膜毒力和分子流行病學研究奠定基礎。

〔1〕Wisselink H J,Smith H E,Stockhofe-Zurwieden N,et al.Distribution of capsular typesand production ofmuramidase-released protein(MRP)and extracellular factor(EF)of Streptococcus suis strains isolated from diseased pigs in seven European countries〔J〕.Vet Microbiol,2000,74(3):237-248.

〔2〕Higgins R,Gottschalk M,Boudreau M,et al.Descrip tion of six new capsular types(29-34)of Strep tococcussuis〔J〕.J Vet Diagn Invest,1995,7(3):405-406.

〔3〕Staats J J,Feder I,Okw umabua O,et al.Streptococcus suis:Past and present〔J〕.Vet Res Commun,1997,21(6):381-407.

〔4〕黃毓茂,黃引賢.2型豬鏈球菌的血清學鑒定〔J〕.中國獸醫學報,1995,11(3):63-65.

〔5〕姚火春,陳國強,陸承平.豬鏈球菌1998分離株病原特性鑒定〔J〕.南京農業大學學報,1999,22(2):67-70.

〔6〕Ausubel FM.精編分子生物學實驗指南〔M〕.北京:科學出版社,1998:39.

〔7〕Charland N,Harel J,Kobisch M,et a1.Streptococcus suis serotype 2 mutants deficient in capsular expression〔J〕.Microbiology,1998,144:325-332.

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Sequence analyses of the Cps2J gene in 9 strains of Strep tococcus suis serotype2 isolated in Zhejiang province

YAO Ping-ping,WANG Fu-su,ZHU Han-ping,M EILing-ling,YE Ju-yian,LUO-Jin,ZHANG-Zheng,YAO Chen-hui

(Zhejiang Center for D isease Prevention and Control,Hangzhou 310051,China)

To exp lo re themolecular characteristics of Strep tococcussuis serotype 2(ss2)isolated in Zhejiang p rovince by deciding the variation lociand its variation frequency of Cps2J gene.The total DNA of 9 strains of ss2 isolated in Zhejiang p rovince were extracted and amplifed by PCR.Then,the Cps2J fragments were cloned into plasmid carrier and comp letely sequenced after purification.Finally,the sequence results of all 9 ss2 isolates were compared with those obtained by other studies around the wo rld.It was found that the open reading fragments of Cps2J in 9 SS2 isolates encoding 333 amino acids were 999 bp in length.Comparisons of this region among ss2 isolates revealed a similarity of between 98.8%and 99.9%,while the homology to ss1 strains varied between 56.8%and 57.0%.Our study show s the sequences of comp lete Cps2J segment are fairly stable and all these 9 ss2 strains of different sources possibly have the same evolutionary o rigin.

Streptococcussuis serotype 2;Cps2Jgene;sequence analyses

R378

A

1002-2694(2010)01-0062-03

1.浙江省疾病預防控制中心,杭州 310051;2.大連醫科大學Email:pingpingyao@yahoo.com.cn

2009-07-15;

2009-11-24