浙江省鼠形動物巴爾通體的遺傳進化分析＊

孫繼民,宋秀平,傅桂明,魯 亮,劉起勇

浙江省鼠形動物巴爾通體的遺傳進化分析＊

孫繼民1,2,宋秀平1,傅桂明2,魯 亮1,劉起勇1

目的 分析浙江省鼠形動物中巴爾通體分子遺傳進化關系,為巴爾通體人群感染的預防控制提供科學依據。方法用夾夜法在浙江省不同地區、不同季節捕獲鼠形動物,無菌操作取鼠肝和脾,用PCR和分離培養檢測巴爾通體,對部分陽性產物測序,提交到 GenBank,用CLUSTAL W進行匹配,然后用PAUP 4.0 beta 10軟件構建系統關系,分析其遺傳進化關系。結果我們分別從黑線姬鼠、黃毛鼠、褐家鼠、黑腹絨鼠、社鼠、臭鼩鼱、東方田鼠、黃胸鼠和大林姬鼠中檢測到巴爾通體特異DNA片段,浙江首次從黑線姬鼠脾中分離出一株巴爾通體。遺傳進化分析顯示我們檢測到的巴爾通體與Bartonella rattim assiliensis以及對人類有致病性的B.graham ii的遺傳關系最近。結論浙江省鼠類中廣泛存在巴爾通體感染,而且攜帶人類致病性巴爾通體,存在人群感染風險。

鼠形動物;巴爾通體;遺傳進化分析

巴爾通體是一類革蘭氏陰性菌,可侵襲宿主的紅細胞和內皮細胞〔1〕,目前巴爾通體包括21個種及亞種,其中至少12種已知可致人類疾病〔2〕。這類細菌的致病譜非常廣,五日熱巴爾通體(Bartonella quintana)可引起戰壕熱、心內膜炎、桿菌性血管瘤〔3〕和流浪人群的菌血癥〔4〕;漢賽巴爾通體 (B.henselae)可以導致桿菌性血管瘤〔5-6〕和心內膜炎〔7-8〕以及最常見的貓抓病〔9-10〕;桿菌狀巴爾通體可以引起秘魯疣(verruga peruana)和奧羅亞熱(Oroya fever)〔11〕,近年來 B.vinsonii Sub sparupensis〔12〕和B.tam iae等數種巴爾通體也先后被報導可對人類致病。

據臨床報道,浙江省貓抓病病例數在國內僅次于江蘇,據第二位,而且浙江省經濟發達,風景優美,有眾多的商貿中心和旅游景點。然而,目前尚沒有從浙江地區分離出巴爾通體的報導,我們也不清楚鼠類的感染情況以及所攜帶巴爾通體是否可對人類致病。所以有必要對浙江省鼠類中巴爾通體感染情況進行調查,并弄清其所攜帶巴爾通體的種類可對人類致病,為保障人類健康提供依據。

1 材料和方法

1.1 樣本采集 2005年12月至2006年12月,分別在天臺、金東、龍泉、臨海、淳安、上虞、龍游、甌海、建德和江山等10個縣區的丘陵、山區、農場、區民區等生境用夾夜法捕獲鼠形動物,所有的鼠形動物分類鑒定,然后無菌操作取肝和脾,置于1.5m L滅菌離心管中,-20℃保存。記錄每只鼠形動物的背景資料,包括編號、采集時間、地點、生境、鼠種、雌雄、體重、頭體長、尾長、耳高等背景資料。

1.2 分離培養 隨機選取10份樣本進行分離培養,每份樣本取25mg鼠形動物的肝脾用研缽研碎,然后加入200μL滅菌胰酶大豆肉湯研成勻漿,接種于含5%脫纖維羊血的胰酶大豆瓊脂培養基上,至于含5%CO2、37℃培養箱中,每天觀察其生長情況并記錄,最長達45d。為預防交叉感染,每只動物的標本單獨用一個研缽,研缽用后高壓滅菌后清洗。

1.3 DNA提取

1.3.1 臟器DNA提取 將臟器研磨后,采用Q IAGEN核酸提取試劑盒,將按照說明書逐步提取DNA。

1.3.2 菌落DNA提取 挑取疑似且革蘭染色鏡下見陰性小桿菌的菌落,收集于含100μL去離子水(p H 8.0)的1.5 mL離心管中,混勻,100℃煮10 min,50 000 r/min離心5 min,上清液即為模板,制成模板后,-20℃保存備用。

1.4 PCR及電泳檢測 反應體系25μL,模板DNA加3μL,10μmol/L引物1μL,Taq DNA 聚合酶1.5 U,10 ×buffer 2.5μL,20 mmol/L M g2+1.5μL,2.5 mmol/L dNTP 2μL,加去離子水至25μL,反應使用PTC2150型DNA儀(MJ Research Inc,Watertow n,MA),反應用引物見表1。取5μL擴增產物,加入1μL電泳載樣液,1%瓊脂糖電泳(4 V/cm)40 min,紫外燈下觀察并拍照。

為避免標本污染引起假陽性反應,標本處理、反應液制備、PCR擴增以及產物分析在不同區域進行,加樣器和移液器分開專用,PCR反應同時設立陽性對照和空白對照(去離子水)。兩對引物擴增產物均陽性判為陽性,如果只有一對為陽性則判為陰性。

表1 PCR反應引物Tab.1 Sequnences of primers

1.5 PCR陽性產物克隆及測序 gltA基因巴爾通體的遺傳學分類標志〔5〕,為進一步鑒定所檢測到的DNA序列,我們選取8例 PCR檢測陽性和1例分離菌株的gltA引物擴增產物用Promega的純化試劑盒純化,然后按照廠家說明書用p GEM-T Easy載體克隆。挑取白色菌落由六合通公司進行測序,預計測序產物長度為379bp。

1.6 序列比對及數據分析 將所得序列與 Gen-Bank中記錄的巴爾通體種類的相同基因進行進化關系分析,所有序列數據用CLUSTAL W進行匹配,然后用PAUP 4.0 beta 10軟件構建系統關系,分析方法為最大簡約法。以布魯氏菌(Brucella abortus)作為外群。

2 結 果

2.1 捕獲動物情況 全省共捕獲427只動物,捕獲數最多的是天臺229只,其次是龍泉76只,其余地區均低于50只。所捕獲鼠形動物的種類包括192只黑線姬鼠、28只社鼠、45只黃毛鼠、27只鼩鼱、7只黃胸鼠、43只褐家鼠、9只小家鼠、37只黑腹絨鼠、9只東方田鼠、23只臭鼩鼱和7只大林姬鼠。雌性230只,雄性197只。

2.2 分離培養結果 從選取的10份樣本中分離出1株巴爾通體,該樣本來自天臺的一只黑線姬鼠。

2.3 PCR檢測結果 共檢測出134份陽性,其中陽性率最高的縣區是臨海為56.3%,龍游和甌海也達到40%,樣本量最多的天臺陽性率為37.1%。檢測陽性的鼠種包括黑線姬鼠、社鼠、黃毛鼠、黃胸鼠、褐家鼠、黑腹絨鼠、東方田鼠、臭鼩鼱和大林姬鼠,我們沒能在鼩鼱和小家鼠中檢測到陽性。雌性的陽性率為30.9%,雄性的陽性率為32%。

2.4 測序結果 8例PCR擴增陽性產物經測序后提交到 GenBank后的注冊號分別為 EU 179229、EU 179230、 EU 179231、EU 179232、 EU 179233、EU 179234 、EU179235和 EU 179236。

2.5 遺傳進化分析 根據gltA基因的進化分析,我們測得的序列聚為兩個群,但這兩個群之間的相似度大于 98%,這兩個群與 B.graham ii和 B.Rattimassiliensis的遺傳關系最近(圖1)。第一個群中,R29ZJ、R60ZJ、R17ZJB、R2ZJJD 和 R3ZJJD的序列完全一致,并且與Ac1692yn(A F391271)、Ad1734yn(AF391278)和 A l1714yn(AF391280)的相似度達到99%,這幾個序列分別來自云南的西南姬鼠,、龍姬鼠和四川姬鼠 (Bai et al.,2002)。R21ZJ和R66ZJB的序列僅有一個堿基不用,R21ZJ第131位為T,R66ZJB相應位置為C,R1ZJB的序列與 R21ZJ也僅在338位有一個不同(C→T),這三個序列與美國西部白腹食蝗鼠血中檢測到的巴爾通體菌株 OL 11554ks(DQ 357612)相似度大于95%(Ying Bai et al.,2007),他們與 B.graham ii(A Y584855)的相似度為96%(圖1)。

圖1 巴爾通體遺傳進化分析圖Fig.1 Phylogenctlc anahysis of Bartonellassp

3 討 論

巴爾通體宿主動物廣泛,除了貓、犬和牛等與人類關系密切的動物外,野生鼠形動物也是巴爾通體的重要自然宿主,是巴爾通體最大的貯存宿主。調查顯示英格蘭和美國東南部鼠形動物的巴爾通體感染率分別為 62.2%(23/37)和 42.7%(119/279)〔13-14〕。據我們所知,目前檢測到巴爾通體的鼠形動物至少包括褐家鼠、黃胸鼠、屋頂鼠、小家鼠、大林姬鼠、日本姬鼠、黃喉姬鼠、小林姬鼠、黑線姬鼠、歐鼠、田鼠、拉布拉多白足鼠、小花鼠、金背黃鼠、加州黃鼠、細足林鼠、白喉林鼠、Sorex vulgaris、鼩鼱、大絨鼠、斯氏家鼠、錫金小鼠、灰麝鼩、大足鼠和臭鼩鼱等〔15-23〕。目前已經有多種巴爾通體從小型獸類中分離出,例如 B.tribocorum,伊麗莎白巴爾通體 ,B.graham ii、B.tay lorii、B.vinsonii vinsonii、B.w ashoensis、B.doshiae、B.birtlesii、B.vinsonii arupensis、 B. rattimassiliensis、 B.Phoceensis等〔24〕。

我們檢測到的巴爾通體與B.Rattim assiliensis的遺傳關系最近,但更重要的是它們與人類致病性巴爾通體B.graham ii的遺傳關系也非常近。這就提示我們浙江省鼠形動物所攜帶的巴爾通體可以對人類致病,存在感染人的風險。

在本研究中,我們從黑線姬鼠、社鼠、黃毛鼠、黃胸鼠、褐家鼠、黑腹絨鼠、東方田鼠、臭鼩鼱和大林姬鼠中檢測到了巴爾通體,從黑線姬鼠的樣本中分離出一株巴爾通體,這是首次從浙江的樣本中分離出巴爾通體,對浙江省巴爾通體的研究奠定了基礎。

綜上所述,我們從浙江省不同地區不同鼠種的樣本中均檢測到了巴爾通體,根據遺傳進化分析所檢測到的巴爾通體與B.graham ii和B.Rattim assiliensis的遺傳關系最近,首次從浙江分離出巴爾通體,為浙江省巴爾通體的預防控制提供了科學依據。

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Phylogenetic analysis of Ba rtonella spp.from rodents of Zhejiang Province

(State Key Laboratory for Infectious Disease Control and Prevention,National Institute for Infectious Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102206,China)

SUN Ji-min,SONG Xiu-ping,FU Gui-ming,LU Liang,L IU Qi-yong

To identify Bartonella spp.from rodents of Zhejiang Province and provide scientific basis for the control and prevention of Bartonella infection in human,murine-like animals were cap tured by night trapping method and their liver and spleen were collected to detect Bartonella by PCR and isolating culturemethod.Part of positive amp liconswere sequenced and submitted to GenBank and phylogenetic analysis was performed by comparison of g ltA fragments with PAUP 4.0 beta 10.Bartonella DNA was detected in 46.9%Samp les of A podemus agrarius,Rattus losea,Rattus norvegicus,Eothenom ysmelanogaster,Niviventer confucianus,Suncusm urinus,M icrotus fortis,Rattus flavi pectus,and Apodem us speciosus.Furthermore,the first Bartonella spp.was isolated from Apodem us agrarius in Zhejiang Province in this study.Phylogenetic analysis showed that the sequenceswere similar to Bartonella rattimassiliensis and Bartonella graham ii.It’s concluded that there exists Bartonella spp.,which could infect human,in small rodents of Zhejiang Province.

murine-like animal;Bartonella spp.;phylogenetic analysis

R376

A

1002-2694(2010)06-0532-03

＊國家自然科學基金(30371246)

劉起勇,Email:liuqiyong@icdc.cn

1.中國疾病預防控制中心,傳染病預防控制所;傳染病預防控制國家重點實驗室,北京 102206;2.浙江省疾病預防控制中心,杭州 310051

2009-11-26;

2009-11-28