IL-15對人γδT細胞殺傷結核桿菌感染THP-1細胞的影響＊

金齊力,韋 莉,姜麗娜,姚春艷李柏青

IL-15對人γδT細胞殺傷結核桿菌感染THP-1細胞的影響＊

金齊力1,2,,韋 莉2,3,姜麗娜2,4,姚春艷1,2,李柏青1,2

目的 建立結核桿菌(M tb)感染單核細胞THP-1細胞系模型;用流式細胞術檢測人γδT細胞對M tb感染THP-1細胞的細胞毒活性;并觀察IL-15對人γδT細胞殺傷 M tb感染 THP-1細胞的細胞毒活性的影響。方法M tb以10∶1的比例感染佛波醇酯(PMA)分化的THP-1細胞,建立M tb感染細胞模型。人外周血單個核細胞用M tb耐熱性低分子多肽類抗原刺激優勢擴增γδT細胞,作為效應細胞用于細胞毒活性實驗。用羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)標記 M tb感染THP-1細胞,作為靶細胞。效應細胞和靶細胞以不同比例孵育4 h,用碘化丙啶(PI)染色后在流式細胞儀上檢測,CSFE和PI雙陽性細胞為被殺傷靶細胞。IL-15作用于γδT細胞24 h后,再檢測γδT細胞對 M tb感染 THP-1細胞的細胞毒活性。結果

人γδT細胞與 M tb感染 THP-1細胞以1∶1至50∶1的比例作用4 h后,人γδT細胞對結核桿菌感染的 THP-1細胞的細胞毒活性從22.5%增加至80.7%;而γδT細胞與未感染 M tb的 THP-1細胞的細胞毒活性為16.1%至47.2%。IL-15作用γδT細胞后的細胞毒活性(64.06%)與對照組(46.81%)相比明顯增加(P<0.05)。結論人γδT細胞對 M tb感染 THP-1細胞的殺傷活性明顯高于對未感染M tb的THP-1細胞的作用,殺傷活性隨效靶比的增加而增加。IL-15可以增強人γδT細胞對 M tb感染巨噬細胞的細胞毒活性。

IL-15;結核桿菌;γδT細胞;THP-1細胞;細胞毒活性

結核病是由結核分枝桿菌(M ycobacterium tuberculosis,M tb)感染引起的一種慢性傳染病,結核分枝桿菌亦簡稱結核桿菌,其入侵的宿主細胞主要是巨噬細胞,并在一定的條件下可在巨噬細胞內存活以及增殖。但活化的巨噬細胞也可銷毀吞噬的M tb,并將其降解成多肽后將抗原信息傳遞給 T細胞,引起特異性的免疫反應。以往的研究表明,M tb感染宿主后可誘導CD4+和CD8+T細胞的特異性免疫應答,并激活巨噬細胞發揮免疫效應,在抗M tb感染中發揮主導作用〔1〕。近年來的研究證明,γδT細胞在抗感染免疫,特別是在抗 M tb感染免疫中同樣發揮重要作用〔2〕。

γδT細胞對 M tb感染巨噬細胞細胞毒活性在研究γδT細胞的抗結核免疫中有重要的意義。本研究建立CFSE/PI雙標記的流式細胞儀檢測技術檢測人γδT細胞對 M tb感染巨噬細胞的細胞毒活性,為深入闡明γδT細胞殺傷 M tb感染巨噬細胞的機理打下基礎。近年來,IL-15在胞內菌感染的免疫應答中的作用得到越來越多的重視。有研究表明IL-15可通過增強CD8+T細胞的免疫應答發揮抗M tb作用〔3〕,本實驗則觀察了 IL-15作用后γδT 細胞對M tb感染巨噬細胞的細胞毒活性,以探討 IL-15對γδT細胞抗M tb感染免疫作用的調節作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞株 結核分枝桿菌 H37Ra株:購于中國生物制品檢定所北京菌種保藏中心,批號:9302025;人單核細胞系 THP-1細胞購自美國A-merican Type Culture Collection公司,用含10%小牛血清的RPM I-1640培養基傳代培養。

1.2 試劑和儀器 異硫氰酸熒光素(fluorescein is othiocyanate,FITC)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DM SO)購自 M erck公司;培養基 RPM I1640,GIBCO公司產品;新生牛血清(NBS)購于杭州四季青生物公司;淋巴細胞分離液(Ficoll-Hypaque),天津 TBD生物技術發展中心產品;重組人白細胞介素2(rh IL-2),長春長生基因藥業公司產品;重組人白細胞介素15(rh IL-15),Pep ro Tech公司產品;二乙酸熒光素(Fluorescein diacetate,FDA)和CFSE購自 Invitrogen;PMA和 PI購自 Sigma公司;抗人CD3-FITC,天津協科生物技術有限公司產品;抗人 TCRγδ-PE,BD公司產品;流式細胞儀FACSCalibur為美國BD公司產品;超聲細胞粉碎機JY-Ⅱ型為寧波新芝生物科技有限公司產品;光學顯微鏡(日本Nikon)。

1.3 M tb菌懸液的制備 見參考文獻〔5〕。

1.4 建立M tb感染PMA分化的 THP-1細胞模型

將凍存的 THP-1細胞復蘇后,置37℃,5%CO2孵箱中培養,收獲指數生長期細胞,以1×106/孔接種于6孔細胞培養板中、每孔2 m L細胞懸液,加入PMA,終濃度為40 ng/m L,24 h后細胞發生巨噬細胞樣變化(貼壁生長,形態不規則,有偽足伸出),此時的THP-1細胞已分化為巨噬細胞。吸去培養液,加入預溫的完全培養液輕輕吹去未貼壁及貼壁不緊的細胞,以10∶1的比例加入 M tb或M tb-FITC懸液,37℃,5%CO2孵育箱孵育過夜,抗酸染色觀察巨噬細胞對M tb吞噬活性,流式細胞術檢測巨噬細胞的吞噬率。

1.5 流式細胞術檢測γδT細胞對M tb感染巨噬細胞的細胞毒活性

1.5.1靶細胞的標記 收集靶細胞(巨噬細胞和M tb感染后的巨噬細胞),調整靶細胞濃度為1×106/m L,用終濃度為 0μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L的CFSE標記靶細胞,37℃,5%CO2孵箱內放置10 m in。用完全培養基洗3次去除殘余的染料,并懸浮于完全培養基中;37℃、5%CO2孵箱內放置4 h后,上流式細胞儀檢測。

1.5.2 效應細胞的準備 常規方法獲取健康成人外周血單個核細胞(PBMC),用含50 m l/L NBS 50 m l/L人自體血清的RPM I1640培養液調整細胞濃度為(1-2)×106/m L,植入24孔細胞培養板中,每孔1mL。加入 M tb.Ag(終濃度5μg/m L)和rh IL-2(終濃度50 U/m L),用于誘導和擴增γδT細胞。當M tb.Ag活化的 T細胞生長到第10天時,流式細胞儀檢測γδT細胞的百分率,γδT細胞的百分率>85%的用于γδT細胞對 M tb感染巨噬細胞的細胞毒活性實驗。

1.5.3 效應細胞與靶細胞活力的測定 調整效應細胞和靶細胞濃度為1×106/m L,取100μL細胞懸液,加入FDA溶液,使其終濃度為50 ng/m L,混勻,室溫下作用5 min,流式細胞儀進行檢測,FDA陽性細胞為活細胞,CELLQuest或W inMD I 2.8軟件分析。用于實驗的細胞活力>90%。

1.5.4 細胞毒試驗 效應細胞和靶細胞混合放入U型96孔板中,反應體系為200μL。設置3個平行復孔,每孔加入8 000個靶細胞,效靶比(效應細胞∶靶細胞,E∶T)分別為50∶1,20∶1,10∶1,5∶1及1∶1。120 g離心2 min。37℃,5%CO2孵育4 h。吸出細胞懸液加入流式管,PBS洗3次。加入4μL PI(100μg/m L),置冰上5 min后 ,60 min內用流式細胞儀分析,用 CellQuest或 WinMD I 2.8軟件獲取和分析數據。FL1熒光通道檢測CFSE的熒光強度,FL 3熒光通道檢測 PI的熒光強度。先以CFSE陽性標記的靶細胞設門為 R1,收集2000個靶細胞。在PI和CFSE雙標記的散點圖中,進一步分析R1門中的靶細胞,其中 PI和CFSE雙標記的細胞為死亡的靶細胞。

1.5.5 IL-15對γδT細胞殺傷 M tb感染巨噬細胞的作用 收集培養的γδT細胞,調細胞濃度為1×106/mL,24孔板中每孔加入1 m L細胞懸液,再加入rh IL-15,終濃度為20 U/m L,作用24 h后收集γδT細胞。效應細胞與靶細胞的作用比例為10∶1,流式細胞儀檢測 IL-15作用后γδT細胞對 M tb感染巨噬細胞的細胞毒活性。

2 結 果

2.1 感染模型的建立 M tb與 THP-1細胞或PMA分化的 THP-1細胞共孵育過夜后,流式細胞儀檢測PM A分化的 THP-1細胞對 M tb的吞噬率達90%以上,見圖1。抗酸染色顯微鏡觀察的結果顯示,感染后90%以上的PM A分化的 THP-1細胞內有3-5個以上的 M tb;而未分化的 THP-1細胞的吞噬率在小于10%,感染后僅有少數 THP-1細胞內有少量的 M tb。

圖1 流式細胞術檢測THP-1細胞在分化前后對 M tb的吞噬率A:未分化的 THP-1細胞對 M tb的吞噬率B:PMA分化后的 THP-1細胞對M tb的吞噬率Fig.1 Phagocytosis rate of THP-1 cells and PM A differentiated THP-1 cells detected by FACS A:Phagocytosis rate of THP-1 cells to Mtb B:Phagocytosis rate of PMA differentiated THP-1 cells to M tb

2.2 不同濃度CFSE標記的靶細胞 靶細胞濃度一定時,以不同濃度的CFSE標記靶細胞,標記4 h后上流式細胞儀檢測,流式分析結果見圖3。CFSE濃度在2μmol/L時,CFSE陽性細胞的峰值在102處,CFSE濃度在4μmol/L時,CFSE陽性細胞的峰值在102-103處,CFSE濃度在8μmol/L時,CFSE陽性細胞的峰值在103處,可以與效應細胞分開,此時的CFSE濃度為實驗用濃度。

圖2 不同濃度CFSE標記的靶細胞Fig.2 CFSE labeled target cellsat different concentrations

2.3 效應細胞與靶細胞存活率的檢測 PBMC經M tb.Ag誘導和擴增后,γδT細胞比例增加,當培養到第10d左右,流式細胞儀檢測γδT細胞比例,選擇人γδT細胞比例達85%以上的用于細胞毒活性檢測,實驗前檢測細胞存活率達90%以上。THP-1細胞和PM A分化后的 THP-1細胞的存活率也可達90%以上,如圖3所示。

2.4 人γδT細胞對巨噬細胞和 M tb感染后巨噬細胞的細胞毒活性 從圖5可以看出人γδT細胞對巨噬細胞和M tb感染后巨噬細胞均有細胞毒活性,且人γδT細胞對兩者的殺傷活性均隨效靶比的增加而增加;在效靶比相同的條件下人γδT細胞對M tb感染后巨噬細胞的殺傷活性高于對未感染巨噬細胞的殺傷活性。不加效應細胞組,M tb感染后的巨噬細胞發生部分凋亡,其自然死亡率高于未用M tb感染的巨噬細胞。

2.5 IL-15對人γδT細胞殺傷 M tb感染 PM A分化 THP-1細胞的影響 IL-15刺激人γδT細胞后,效應細胞與靶細胞以10∶1的比例作用,人γδT細胞對M tb感染后的PMA分化 THP-1細胞的殺傷活性為(64.06±4.07)%,IL-15刺激前人γδT細胞對M tb感染后的 PMA分化 THP-1細胞的殺傷活性為(46.81±2.04)%,差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

THP-1細胞來源于人急性單核細胞白血病細胞,其細胞表型和分化更能完整的代表實驗中人單核巨噬細胞系統的功能趨勢,ST細胞比動物細胞能更真實地反映人類實驗模式,因此是目前運用較多的用以研究單核巨噬細胞分化及功能的細胞模型。THP-1細胞在 PMA分化前后對 M tb的吞噬能力有很大差異。THP-1細胞對 M tb的吞噬能力較低;PMA分化后的 THP-1細胞變得具粘附、貼壁、特性形態不規則,此時的THP-1細胞可認為是巨噬細胞,對M tb的吞噬能力變強。我們用流式細胞術以及抗酸染色后顯微鏡檢的方法 M tb感染巨噬細胞的模型加以驗證,兩種方法檢測的結果一致,但用流式細胞術檢測單核巨噬細胞對 M tb的吞噬作用,方法簡便、快速、客觀、重復性好。

圖3 γδT細胞與靶細胞活力檢測A:M tb A T中γδT細胞百分率;B:γδT細胞的活力;C:M tb感染的巨噬細胞的活力;D:未感染巨噬細胞的活力Fig.3 The vitality of gammadelta T cellsand target cells A:The percentage of gammadelta t cells in M tb A T;B:The viability of gammadelta T cells;C:The viability of M tb infected macrophages;D:The viability of uninfected macrophages

本實驗用經 PMA誘導分化后的 THP-1細胞作為 Mtb感染對象,建立和完善了體外研究 M tb與巨噬細胞相互作用的模型。用CFSE/PI雙標記的流式細胞術檢測γδT細胞對 M tb感染巨噬細胞的細胞毒活性。傳統檢測γδT細胞細胞毒活性的方法是51Cr釋放實驗,雖然這種方法重復性好,操作簡單,但它仍有幾個缺點,如標記的細胞51Cr自發釋放率高;細胞殺傷的實際情況和51Cr標記的細胞內蛋白釋放入上清液有時間延遲;在總體水平檢測細胞的裂解,而不是在單細胞水平上;需處理放射性同位素等等。流式細胞術檢測細胞毒的方法基于單細胞水平,克服了上述方法的缺陷,實驗原理是先用第一種熒光染料CFSE標記靶細胞,用以區分效應細胞和靶細胞。再用第二種DNA熒光染料 PI來區分細胞膜已破壞的靶細胞并計算其百分率。此方法中CFSE標記靶細胞的濃度很關健,我們通過多次實驗發現,靶細胞濃度在1×106/m l的條件下,終濃度8μmol/L的 CFSE是較理想的標記濃度,此時CFSE陽性靶細胞的峰值在103處,可以很好的區分效應細胞和靶細胞,且對靶細胞的活性沒有影響。

實驗顯示人γδT細胞對巨噬細胞和 M tb感染巨噬細胞均有細胞毒活性,且隨著γδT細胞與靶細胞比例的增加,人γδT細胞對靶細胞的細胞毒活性亦增強。在相同效靶比的情況下,人γδT細胞對M tb感染巨噬細胞的細胞毒活性強于對未感染巨噬細胞的細胞毒活性,這可能與 M tb感染后巨噬細胞表面分子表達發生變化,人γδT細胞易于識別有關。γδT細胞表面可以表達C型凝集素家族跨膜蛋白N KG2D,可以識別 M HC-I類鏈相關分子 A(M HC class I chain-related molecules A,MCIA),M ICA應激性表達在一些腫瘤細胞或病原體感染細胞的表面。有研究顯示N KG2D-M ICA相互作用可以直接活化 Vγ9Vδ2細胞〔6〕,而 IL-15可以增加人γδT細胞N KG2D的表達,在加強抗 M tb感染的保護性免疫應答中發揮一定的作用〔7〕。我們在實驗中發現 IL-15刺激后的人γδT細胞對 M tb感染巨噬細胞的細胞毒活性增強。現有研究證明人γδT可以通過顆粒酶和穿孔素途徑殺傷 M tb感染巨噬細胞〔8〕,人γδT細胞是否通過N KG2D途徑殺傷結核桿菌感染巨噬細胞有待進一步的實驗證明。

圖6 IL-15對人γδT細胞殺傷 M tb感染巨噬細胞的影響Fig.6 The influence of cytotoxicities of gdT cellsagainst M tb infected macrophages

在過去十多年的研究中,國內外眾多學者對γδT細胞在抗結核感染中的作用作了大量的研究,使我們對γδT細胞參與結核感染時的作用機制及γδT細胞與其它細胞亞群之間的相互作用有了一定認識,但由于γδT細胞表現型的多樣性和分泌細胞因子的復雜性,使得其對抗原識別的分子機理、參與調節免疫應答、免疫耐受的確切機制等問題尚不甚明了,還有很多現象難以解釋,甚至出現了一些前后矛盾的結果。但有一點已經得到廣大學者的肯定,那就是γδT細胞在結核感染免疫中能對宿主提供保護作用。在抗感染方面,國外已經開展針對 IL-15的基因治療,而國內這方面研究比較少,開展針對IL-15的研究可為防治胞內病原體感染提供新的思路和策略。

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〔4〕Umemura M,Nishimura H,Hirose K,et al.Overexpression of IL-15 in vivo enhances protection against Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Gurin infection via augmentation of NK and T cytotoxic 1 responses〔J〕.J Immunol,2001,167(2):946-956.

〔5〕金齊力,姜麗娜,姚春艷,等.流式細胞術檢測單核巨噬細胞吞噬熒光素標記結核分枝桿菌的方法學探討〔J〕.蚌埠醫學院學報,2008,33(5):505-508.

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〔8〕Dieli F,Troye-Blomberg M,Ivanyi J,et al.Granulysin-dependent killing of intracellular and extracellular Mycobacterium tuberculosis by Vγ9/Vδ2 T lymphocytes〔J〕.J Infect Dis,2001,184(8):1082-1085.

Effect of interleukin 15 on the cytotoxicity of humanγδT cellsagainst Mycobacterium tuberculosis infected THP-1 cells

JIN Qi-li,W EILi,JIANG Li-na,YAO Chun-yan,L IBai-qing

(1.Department of Imm unology,Bengbu M edical College;2.Anhui Key Laboratory of Infection and Immunity at Bengbu Medical College;3.Department of Pathogen Biology,Bengbu Medica l College;4.Department of Pathophysiology,Bengbu Medical College 233030,China)

To establish themodel of M ycobacterium tuberculosis(M tb)infected THP-1 cells,THP-1 cellswere infected by Mtbat a 10∶1 ratio for 18 h.And to establish themethod for detection of cytotoxicity of human gd T cells against M tb infected THP-1 cells,peripheral blood mononuclear cells(PBMC)from normal human subjects were stimulated with Mtb.Ag to generate M tb.Ag activated T cells(M tb.A T)that wereγδ T cellsp redominantly and as the effector cells(E).And the Mtb infected THP-1 cells labeled with CFSE as target cells(T).The effector cellsand target cells were cocultured for 4 h with different proportions,and both CFSE and PIpositive cells analyzed by flow cytometry as the killed target cells were stained with PI.While human gd T cells and THP-1 cells were cocultured for 4 h at the proportions from 1∶1 to 50∶1,the cytotoxicities of humanγδT cells increased from 16.1%to 47.2%.As humangd T cells and M tb infected THP∶1 cells were cocultured for 4 h at the proportions from 1 ∶1 to 50 ∶1,the cytotoxicities of humanγδT cells increased from 22.5%to 80.7%.It’s concluded that the cytotoxicities of humanγδT cells against Mtb infected THP∶1 cells are higher than uninfected THP-1 cells.Furthermo re,the cyto toxicities increase when E/T proportions increase and IL-15 could enhance the cytotoxicities of humanγδ T cells against M tb infected macrophages.

IL-15;M ycobacterium tuberculosis;γδ T cells;THP-1 cell;cytotoxicity

2.安徽省感染與免疫重點實驗室,蚌埠233030;3.蚌埠醫學院病原生物學教研室,蚌埠 233030;4.蚌埠醫學院病理生理學教研室,蚌埠 233030

R378

A

1002-2694(2010)10-0926-05

＊國家科技重大專項基金課題(2008ZX10003011),安徽省省級重點實驗室重點科研項目(2004 sys008),蚌埠醫學院院級科研項目(BY0918))

李柏青,Email:baiqingli@bbmc.edu.cn

1.蚌埠醫學院免疫學教研室,蚌埠 233030;

2009-12-21;

2010-03-24