漢坦病毒Z5株M和S片段全基因序列測定及分析

李 嬋,謝榮輝,朱函坪,徐 芳,姚蘋蘋,程胤凱,朱智勇

漢坦病毒Z5株M和S片段全基因序列測定及分析

李 嬋,謝榮輝,朱函坪,徐 芳,姚蘋蘋,程胤凱,朱智勇

目的 測定漢坦病毒Z5株M、S片段的全長序列,了解其分子結構特征,并分析Z5與其他漢坦病毒株的遺傳學差異。方法設計引物,用RT-PCR技術擴增Z5株全長M與S片段。PCR產物純化后克隆入 T載體并測定序列及分析。結果Z5株M片段的全基因序列含有3 616個核苷酸,編碼1 135個氨基酸。S全基因序列含有1 700個核苷酸,編碼429個氨基酸。經核苷酸與氨基酸同源性分析,Z5株應屬于漢坦病毒的漢灘型(HTN型)毒株,與Z10株同屬一個亞型。結論

Z5株病毒和其他漢灘病毒病毒在核苷酸序列上有差異,但在氨基酸水平上的同源性仍較高。關鍵詞:漢坦病毒;M和S基因片段;序列分析

漢坦病毒引起的疾病是一種人獸共患性疾病,在世界各大洲均有流行,到目前為此世界各地報道的漢坦病毒至少有二十多個血清型/基因型,其中半數以上被確定對人具有致病性,一些新的漢坦病毒屬成員還在不斷的發現中,漢坦病毒感染及其引起的相關疾病已成為嚴重的世界公共衛生問題之一〔1-4〕。漢坦病毒(Hantavirus)是引起腎綜合征出血熱(HFRS)的病原體,屬布尼亞病毒科,其基因組由大(L)、中(M)和小(S)3個基因片段的單股負鏈RNA組成,分別編碼多聚酶、外膜蛋白及核蛋白。

漢坦病毒Z5株經本實驗室測定是一株具有高免疫原性的病毒,為了進一步了解該株病毒生物學特性的分子基礎及浙江省內漢坦病毒的變異狀況,我們應用RT-PCR擴增技術對該株病毒的M和S片段的全基因進行序列測定和分析,為進一步深入研究提供條件。

1 材料和方法

1.1 細胞和毒株 病毒培養所用的Vero-E6細胞,漢坦病毒Z5毒株由本實驗室保存。

1.2 引物的設計和合成 參考已知的漢坦病毒標準株76-118株M和S片段的核苷酸序列及相關文獻,設計M片段的二對引物 HV-M F:5’-GTAGTAGACTCCGCAARARAMAGCAGT,HV-MR:CCWACSCCA TGRGCA TTA TCW KTCCA,HVM F1:5’-A TCCA TM YTSTGGGCTGCAAGTGC-3’,HV-M R1:TA GTA GTA GACTCCGCAAGA TGT-3’;S片段的一對引物 HSPF:5’-TAGGAGCAGACTCCCTAAA GAGCTACT-3’,HSPR:5’-TAGTAGTAGGCTCCCTAAAAAGACAA-3’并由上海生工合成。

1.3 病毒RNA的提取 細胞長成單層后,用病毒感染Vero-E6細胞,培養6～7d后,用間接免疫熒光法檢測細胞感染的程度,待80%細胞有病毒感染時,收獲病毒,利用 Rneasy M ini Kit按說明書從病毒細胞培養液中提取總RNA。

1.4 RT-PCR和克隆 用MLV逆轉錄酶(Promega),參照說明書進行操作。PCR循環參數為94℃預變性 2m in,94℃變性 15s,55℃退火 30s,72℃延伸2min 15s,35次循環后,72℃延伸10min,最后置于4℃。PCR產物在瓊脂糖上進行電泳后,切下目的條帶,用膠回收試劑盒M iniElute Gel Extraction Kit回收目的片段。將目的片段克隆于 T載體,轉化DH5a感受態細胞,在含有 Amp、X-gal、IPTG的LB平板培養基上培養18h。選取菌落進行小量培養,堿裂解法提取質粒,進行陽性克隆株的PCR鑒定。

1.5 核苷酸序列測定和分析 篩選的陽性克隆經PCR鑒定,將篩選得到的陽性克隆株送上海生物工程有限公司測序,并用DNASTAR對其進行序列的比較及分析。

2 結 果

2.1 直接免疫熒光法檢測抗原 Z5株感染的Vero-E6細胞進行免疫熒光試驗,在熒光顯微鏡下可見特異性的熒光顆粒,而正常的細胞在熒光顯微鏡下沒見到特異性的熒光顆粒。

2.2 M,S片段的特異的RT-PCR擴增 M片段擴增二條約2.1kb和1.7kb左右的條帶,而S片段則擴增產物分子量大小約1.7kb,與預期結果相符(見圖 1)。

圖1 RT-PCR擴增圖Fig.1 Ampification results of M and S gene of hantavirus strain Z5 M:250bp marker;1-2:RT-PCR product of M gene of hantavirus strain Z5;3:RT-PCR product of S gene of hantavirus strain Z5

2.3 M和S片段的核苷酸序列及分析 序列測定表明(GenBank登錄號DQ159911),Z5毒株M片段的全基因序列共有3616個核苷酸,4種核苷酸的比例分別為 A 30.5%,G 21.5%,T 29.5%,C 18.5%,A T含量為59.98%,GC含量為40.02%。序列分析表明Z5株M全基因片段只有1個開放閱讀框架,起始密碼子位于41-43個核苷酸,終止密碼子位于3446-3448個核苷酸,共編碼1135個氨基酸。氨基酸序列分析表明 G1和 G2含有11個潛在的天門冬酰氨糖基化位點,其中 G1內有9個糖基化位點,與 hantaan型相比,有 5個保守,還有其中二個與Z10一樣的特有性位點;與Seoul型相比只有,只有3個保守。G2含有2個糖基化位點,與 Hantaan及Seoul型病毒相比,兩個都保守。Z5株的 G1和 G2均富含半胱氨酸;其中 G1含有36個半胱氨酸,G2含有28個半胱氨酸。這些半胱氨酸形成的二硫鍵對維持 G1與 G2的空間構象具有很大作用。與Z10株M基因核苷酸序列相比較,Z5株共有215處變異,其同源性達到94.0%。在ORF中發生變異共有201處,但僅有20處發生錯義突變,氨基酸的變異較小。Z5株與其它 H TN型病毒核苷酸同源性為81.3%～91.3%。

S片段序列測定表明(GenBank登錄號EF103195):Z5株S片段的全基因序列共有1 700個核苷酸,4種核苷酸的比例分別為 A 30.9%,G23.6%,T25.9%,C19.6%。A T含量為56.8%,GC含量為43.2%。序列分析表明Z5株S片段只有1個開放閱讀框架,其編碼框架從37至1326,由1290個核苷酸組成,編碼429個氨基酸。S片段的5’和3’末端非編碼區分別由36個和374個核苷酸組成,其中 Z5的3’端非編碼區(NCR),屬于S基因片段的高變區。Z5株核苷酸序列與疫苗株Z10的同源性最高,為97.6%。與Z10株S基因核苷酸序列相比較,Z5株共有41處變異,但在ORF中有32處變異,其中 5處為錯義突變,即 320nt(A-T),580nt(G-C),924nt(A-G),1106nt(A-G),1235(GA),相應的氨基酸變化為95(K-M),182(A-P),300(K-E),357(K-R),400(G-D)。

2.4 漢坦病毒Z5株M和S片段核苷酸及氨基酸序列同源性比較及進化分析 與 GenBank已報道的23株hantavirus M全基因片段進行序列同源性分析,Z5株與 HTN型同源性為81.3%～94.0%,與SEO型同源性為70.0%～79.4%,而與其他各型病毒間的同源性更低。其推導的氨基酸序列與H TN型同源性為94.9%～98.8%,與SEO型同源性為76.2%～77.3%。Z5 S片段與 HTN型S片段同源性為86.4%～97.6%,與 SEO型同源性為82.8%～83.3%,而與其他型別的同源性更低,其編碼的核蛋白氨基酸序列與HTN同源性為96.5%～99.1%;與SEO型同源性為82.8～83.5%,與其他型別漢坦病毒核蛋白同源性僅有62.7%～65.0%。從M,S基因片段核苷酸的系統發生樹分析(圖2,3,4,5),Z5毒株與Z10株的親緣關系最為接近,為同一亞型。

3 討 論

本文對漢坦病毒Z5株M和S進行了克隆和核酸的序列分析,設計引物RT-PCR方法得到了 Z5核蛋白基因及二個M基因的部分片段,在PCR擴增過程中,利用 Taq酶在產物片段3’末端外加的A的特性,選擇p GEM-T載體,使該目的基因與載體連接效率提高,并使篩選重組克隆時的假陽性大為減少,篩選工作簡捷有效,大大提高克隆速度,節省了試劑費用及實驗時間,為進一步了解 Z5株基因組結構、生物學特性、致病機理等提供了分子基礎。

序列分析結果表明,Z5株M片段的全基因序列共3 616個核苷酸,編碼1 135個氨基酸,與漢坦病毒的其它株相似〔4〕,但又區別于它們。S片段的全基因序列共1 700個核苷酸,編碼429個氨基酸。同已報道的漢坦病毒基因比較表明,Z5株病毒屬于漢灘型病毒;S片段的核苷酸同源性為86.4%～97.6%,氨基酸同源性為96.5%～99.1%;M片段的核苷酸同源性為81.3%～94.0%,氨基酸同源性為94.9%～98.8%。而與其他型別的病毒同源性較遠。目前研究發現漢坦病毒的3個基因片段的核苷酸變異以M片段基因的變異最為顯著,可能與M基因編碼的囊膜蛋白承受的來自漢坦病毒感染宿主的免疫壓力最大有關。漢坦病毒的S基因相對于M基因而言,具有相對的保守性,但3’端具有高度的變異性,不同型別的漢坦病毒此區域的長度從754個核苷酸到331個核苷酸不等,即使同型別的漢坦病毒此區域的長度也不同,Z5株與同型別病毒3’端核苷酸的長度有一定差異,與其它型別核苷酸長度差異更大。

與其他漢坦病毒一樣,Z5株的M片段也富含半胱氨酸;其中 G1含有36個半胱氨酸,G2含有28個半胱氨酸,對維持 G1和 G2的空間構象及病毒抗原性具有十分重要的作用。潛在的天門冬酰氨糖基化位點對糖蛋白的結構和抗原性至關重要,漢坦病毒Z5株含有11個潛在的天門冬酰氨糖基化位點,這可能是Z5株具有高免疫原性的原因之一。有關Z5株病毒存在多個潛在天門冬酰氨糖基化位點對其糖蛋白結構和抗原性的影響有待于進一步研究。

〔1〕Miyamoto HH,Kariwa K,A raki K,et al.Serological analysis of hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS)patients in Far Eastern Russia and identification of the causative hantavirus genotype〔J〕.A rch Virol,2003,148:1543-1546.

〔2〕Kruger DH,Ulrich R,Lundkvist AA.Hantavirus infections and their prevention〔J〕.Microbes Infect,2001,3:1129-44.

〔3〕Vapalaphti O,Mustonen J,Lundkvkist A,et al.Hantavirus infections in Europe〔J〕.Lancet Infect Dis,2003,3:653-661.

〔4〕Padula PJ,Sanchez AJ,Edelstein A,et al.Complete nucleotide sequence of the M RNA segment os Andes virus and analysis of the variability of the termini of the virus S,M and L segments〔J〕.J Gen Virol,2002,83:2117-2122.

Full-length nucleotide sequence analysis of the S and M segments in Z5 strain of Han tavirus Z5 strain

L IChan,XIE Rong-hui,ZHU Han-ping,XU Fang,YAO Ping-ping,CHENG Yin-kai,ZHU Zhi-yong

(Zhejiang Provincial Center for Disease Prevention and Control,Hangzhou 310009,China)

The M and S segment cDNA s of hantavirus Z5 strain was amp lified by RT-PCR,and the purified PCR productswere cloned into vector p GEM-T and then sequenced.It was demonstrated that the M genome segment of Z5 was found to be 3 616 nucleotides in length with a single open reading frame encoding 1 135 amino acids.And the S genome segment was 1700 nucleotides in length with a single open reading frame encoding 429 amino acids.As demonstrated by the homologous analysis of nucleotides and amino acids,it was showed that the Z5 strain belonged to hantaan viruses HTN type and was the same subtype of the Z10 strain.It is conclouded that difference in nucleotide sequence exists between Z5 strain with other Hantavirus strains but high level of homology in amino acid sequences is still p resent.

Hantavirus;M and S segment;sequence analysis

R373.3

A

1002-2694(2010)03-0215-03

＊浙江省自然科學基金(Y205700)

浙江省疾病預防控制中心出血熱重點實驗室,杭州310051;Email:ghost_rhxie@hotmail.com

2009-07-16;

2009-11-19