中晚期消化系惡性腫瘤 CIK細胞治療前后免疫功能變化的價值

林 蘭,劉繼斌

(1.南通市腫瘤醫院檢驗科,江蘇南通 226361;2.南通市腫瘤醫院腫瘤研究所,江蘇南通 226361）

中晚期消化系惡性腫瘤 CIK細胞治療前后免疫功能變化的價值

林 蘭1,劉繼斌2

(1.南通市腫瘤醫院檢驗科,江蘇南通 226361;2.南通市腫瘤醫院腫瘤研究所,江蘇南通 226361）

目的探討經CIK細胞治療的中晚期消化系惡性腫瘤患者治療前后外周血淋巴細胞多種免疫指標的變化及在CIK細胞治療效果評估中的價值。方法采用流式細胞術檢測53例中晚期消化系惡性腫瘤和 30例健康體檢者外周血中 8種免疫指標變化,并比較分析 53例中晚期消化系惡性腫瘤患者應用CIK細胞治療前后 8種免疫指標的表達。結果中晚期消化系惡性腫瘤患者免疫功能低下 (P＜0.05）;患者CIK細胞治療前后 CD 4、CD 19、CD3/CD 16+CD 56比較差異有統計學意義(P＜0.05）。比較差異有統計學意義(P＜0.05）。結論采用流式細胞術檢測外周血免疫指標的變化為臨床觀察中晚期消化系惡性腫瘤患者CIK細胞治療前后免疫狀態變化提供了有效的依據;CIK細胞治療可激活T淋巴細胞而改善免疫功能;外周血免疫指標可用于治療效果的評價。

中晚期消化系惡性腫瘤;CIK細胞;流式細胞術;淋巴細胞

細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killers,CIK）在體外可大量擴增,并具有一定的抗腫瘤效應。與其他抗腫瘤藥物相比,CIK細胞可以在不損傷機體免疫系統結構和功能的前提下,直接殺傷腫瘤細胞,并可調節和增強機體的免疫功能。本觀察采用流式細胞術檢測淋巴細胞的一些表面抗原在中晚期消化系惡性腫瘤患者外周血中的表達,并探討 CIK細胞治療前后患者免疫功能改變,以期為評估 CIK細胞治療效果提供有效的試驗數據。2003年 10月至 2009年 3月共有 53例中晚期消化系惡性腫瘤在我院接受CIK細胞治療,現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 惡性腫瘤組 53例中晚期消化系惡性腫瘤,均經影像學、細胞學及病理學檢查等確診;其中男性 33例,女性 20例;年齡 31～76歲,平均年齡 56歲,其中 40～60歲者占 92.4%;根據國際抗癌聯盟分期標準進行臨床分期,其中Ⅰ ～Ⅱ期 5例(9.4%）,Ⅲ～Ⅳ期 48例(90.6%）;腫瘤類型:食管癌 16例,肝癌13例,結腸癌 10例,胃癌 12例,胰腺癌 2例。對照組30例為健康體檢者,其中男性 16例,女性 14例;年齡30～52歲,平均年齡 41歲。兩組年齡和性別構成比比較差異無統計學意義(P＞0.05）。

1.2 CIK細胞的制備及回輸 采用 Ficoll密度梯度離心法分離異體外周血單個核細胞,用 RPMI-1640培養基洗滌 3次,將細胞按 2×106m L-1的濃度懸浮于RPMI-1640培養基中。參照美國斯坦福大學骨髓移植中心建立的 CIK細胞培養方法:第 0天加入 IFN-γ500 u/mL,置于 37℃、體積分數 5%CO2孵箱中培養 24h,第 1天加入 IL-2 300 u/mL、CD3 10 μg/m L、IL-1 100 u/mL繼續培養,觀察細胞生長,并根據情況進行擴增。以后每 3 d換液 1次并調整細胞數為 2×106m L-1,置于 37℃、體積分數 5%CO2孵箱中連續培養10～12 d后用臺盼藍計數。CIK細胞培養 14～28 d后,取少許培養細胞做流式細胞術檢測,當 CD3+CD56+細胞數 ≥50%,CD3+CD8+細胞≥30%,且微生物學檢查陰性時收集細胞。經生理鹽水洗滌 3次,加入含質量分數 1%人血白蛋白生理鹽水中回輸體內,1次 /d,5 d為 1個療程[1]。

1.3 材料與儀器 小鼠抗人單克隆抗體 CD4/CD8/CD3、CD19、CD3/CD16+CD56及同型對照,紅細胞裂解液均購自蘇州基因公司。流式細胞儀為美國 Beckman Coulter公司產品。

1.4 檢測方法 采取直接免疫熒光標記全血溶血法,用流式細胞儀測定腫瘤患者外周血淋巴細胞表面抗原的表達,具體步驟如下。淋巴細胞表面標記:取熒光標記單克隆抗體 CD4/CD8/CD3、CD3/CD16+CD56、CD19各 10μL放入試管中,分別加入外周全血 100 μL,室溫避光孵育 15min,并作同型對照;溶血:加入Optilyse C溶血劑 500 mL,混勻,室溫避光 10m in;洗滌:以 1 500 r/min的速率離心 5min,棄上清液,加入PBS 1 mL,混勻,重復洗滌 1次;重懸:加入 PBS 1 mL,混勻,制成單細胞懸液;檢測:上流式細胞儀,每個樣品檢測 5 000個以上的細胞,用軟件分析計算淋巴細胞中各標記細胞的比例。

1.5 統計學處理 采用 SPSS10.0軟件進行分析。計數資料用百分數表示,比較采用 χ2檢驗;計量資料用±s表示,比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 兩組免疫指標的表達情況 惡性腫瘤組 53例中晚期消化系惡性腫瘤與對照組 30例健康體檢者的各免疫指標比較差異均有統計學意義(P＜0.05）,提示中晚期消化系惡性腫瘤患者的免疫功能低下。詳見表1。

表 1 惡性腫瘤組與對照組各免疫指標的比較(±s）

表 1 惡性腫瘤組與對照組各免疫指標的比較(±s）

注:1）與對照組相比,P＜0.05

組別 例數 CD 3 CD 4 CD8 CD19 CD 3/CD 16+CD 56對照組 30 59.52±48.44 39.24±8.36 24.14±9.36 11.75±3.76 17.21±7.42惡性腫瘤組 53 54.12±47.471） 35.34±5.351） 22.14±8.271） 8.98±1.451） 12.27±5.591）

2.2 惡性腫瘤組治療前后免疫指標的變化 CIK細胞治療前與CIK細胞治療后相比,惡性腫瘤組 53例中晚期消化系惡性腫瘤的 CD3差異無統計學意義(P＞0.05）,CD4差異有統計學意義(P＜0.05）,CD8差異無統計學意義(P＞0.05）,CD19差異有統計學意義(P＜0.05）,CD3/CD16+CD56差異有統計學意義(P＜0.05）。詳見表 2。

表2 CIK細胞治療前后惡性腫瘤組各免疫指標變化(±s）

表2 CIK細胞治療前后惡性腫瘤組各免疫指標變化(±s）

注:1）與治療前相比,P＜0.05

組別 例數 CD 3 CD 4 CD8 CD19 CD 3/CD 16+CD 56 CIK治療前 53 54.12±47.47 35.34±5.35 22.14±8.27 8.98±1.45 12.27±5.59 CIK治療后 53 60.23±51.55 39.56±6.671） 21.24±5.68 12.45±1.781） 19.23±8.121）

3 討論

惡性腫瘤患者通常免疫功能狀態紊亂、低下,而免疫功能狀態在一定程度上可預示腫瘤的發展和預后[2]。眾所周知,機體的細胞免疫由 T淋巴細胞介導,T淋巴細胞的主要功能是調節蛋白質抗原引起的所有免疫應答,并具有清除細胞表面抗原或細胞內微生物的效應作用。CIK細胞是患者外周血單個核細胞在體外經過多種細胞因子共同誘導而獲得的以CD3+CD8+細胞毒性 T淋巴細胞和 CD3+CD56+T淋巴細胞為主的異質細胞群,兼具有 T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性和 NK細胞非 MHC限制性殺瘤活性,且體內外增殖能力強,是一類殺瘤活性和殺瘤譜更強的新型抗腫瘤效應細胞[3-5]。目前,國內外制備的用于過繼免疫治療的 CIK細胞實際是體外擴增出的以CD3+CD56+、CD3+D8+T淋巴細胞為主的異質性細胞群,體內回輸 CIK細胞,可以在不損傷機體免疫系統結構和功能的前提下,直接殺傷腫瘤細胞,并可調節和增強機體的免疫功能[6-7]。

以往,腫瘤的診斷及預后的判斷主要依據病理學檢查,這種方法缺乏定量分析,且易受主觀影響。而機體的免疫功能狀態與腫瘤的發生、發展及預后有關,免疫功能較好的患者,預后相對較好,反之亦反;因此,檢測患者免疫指標有助于判斷病情和指導治療[8]。本觀察結果顯示,患者組各免疫指標明顯低于對照組,這表明中晚期消化系惡性腫瘤患者的免疫功能低下,且NK細胞的殺傷活性較低,與文獻報道一致[9]。惡性腫瘤組 CIK細胞治療前后各免疫指標的變化情況提示,經過免疫治療后,體內腫瘤細胞分泌的可溶性免疫抑制因子減少,同時機體通過 T淋巴細胞的免疫應答,導致 CD4+T細胞活性加強,調節激活了 T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞的功能,從而改善了機體的細胞免疫功能;治療后相關免疫活性細胞如 T淋巴細胞、B淋巴細胞和 NK細胞數量呈上升趨勢,這與治療后瘤體有不同程度縮小相吻合。本觀察結果還提示,惡性腫瘤患者的免疫功能存在缺陷,而 CIK細胞治療可改善患者 T淋巴細胞的數量和比例;同時,亦可直接刺激T淋巴細胞的活化,增強機體細胞和體液免疫功能。

綜上所述,采用流式細胞術檢測外周血免疫指標的變化為臨床觀察中晚期消化系惡性腫瘤患者 CIK細胞治療前后免疫狀態變化提供了有效的依據;CIK細胞治療可激活 T淋巴細胞而改善免疫功能;外周血免疫指標可用于治療效果的評價。

[1] 朱建平,徐鳴,汝美華.CIK細胞臨床應用中的制度建設探討[J].中國醫藥生物技術,2007,2(3）:226-227.

[2] 畢愛華,龔非力.醫學免疫學[M].北京:人民軍醫出版社,1995:12-848.

[3] 陳復興,劉軍權,張南征,等.自身細胞因子誘導的殺傷細胞過繼性免疫治療惡性腫瘤的臨床觀察[J].癌癥,2002,21(7）:797-801.

[4] 杜清友,劉明旭,王福生,等.CIK細胞體內外抗肝癌細胞作用[J].中國癌癥雜志,2001,11(4）:325-327.

[5] 張有順,黃玲,楊紅玲,等.肝癌患者 CIK細胞的誘導及對肝癌細胞毒作用的研究[J].上海免疫學雜志,2003,23(3）:201-203.

[6] Margolin KA,Negrin RS,Wong KK,etal.Cellular immunotherapy and autologous transplantation for hematologic malignancy[J].Immunol Rev,1997,157:231-240.

[7] Lu PH,Negrin RS.A novel population of expanded human CD 3+CD 56+cellsderived from T cells with potent in vivo antitumor activity in mice with severe combined immunodeficiency[J].J Immunol,1994,153(4）:1687-1696.

[8] 楊家啟,楊波,祁巖超.細胞免疫治療后腫瘤患者外周血淋巴細胞絕對數值變化的研究[J].中外醫療,2008,27(6）:37-38.

[9] 韓曉紅,石遠凱,馮奉儀,等.流式細胞術分析腫瘤患者免疫功能變化[J].實用腫瘤雜志,1999,14(5）:273-275.

The Changes of Immune Function in Patients with Advanced Digestive Tract Cancer Treated by CIK Cells

Lin Lan1,Liu Jibin2
(1.Departmentof Clinical Laboratory,Nantong Tumor Hospital,Nantong 226361,China;2.The Institute ofOncology,Nantong Tumor Hospital,Nantong 226361,China）

ObjectiveTo investigate the changes ofmultip le immune indexes in peripheral blood of patients with advanced digestive tract cancer and the clinical valueof the indexes for the effectof the CIK cells treatment.MethodsFlow cytometrywas employed for determ ining the 8 indexes of 53 patientswith advanced digestive tract cancer and 30 healthy persons.The exp ression results beforeand after the CIK cells treatment of 53 patients were compared.ResultsThe immune function of patients with advanced digestive tract cancers were low(P＜0.05）.For the 53 patientswho

CIK cells treatment,the CD4,CD 19 and CD 3/CD16+CD56after the treatmenthad statistic differences compared by those before the treatment(P＜0.05）.ConclusionDeterm ining the immune indexes by flow cytometry provides an effective basis for evaluating the immune function of patients with advanced digestive tract cancer.CIK cells treatment can activate T lymphocyte,so as to imp rove immune function.

advanced digestive tract cancer;CIK cells;flow cytometry;lymphocyte

R 735;R 730.54

A

1673-5412(2010）05-0399-03

林蘭(1969-）,女,主管檢驗師,主要從事腫瘤臨床檢驗及相關工作。E-mai:ntzlyyl2010@163.com

劉繼斌(1974-）,男,副主任技師,主要從事腫瘤的臨床檢驗診斷研究。E-mail:tians2008@163.com

2010-07-12）