四氯聯苯對雞外源原始生殖細胞遷移的影響

張易祥,金秀梅,李贊東*,劉 莉,采克俊,丁志麗 (.中國水產科學研究院湖州師范學院,細胞工程研究所,浙江 湖州 33000；.中國農業大學生命科學院,北京 00094)

多氯聯苯(PCBs) 是聯苯被氯原子取代后的產物,由于其脂溶性強,半衰期長,在環境中不易降解,易通過食物鏈富集在人和動物體內,已造成全球性的污染[1-2].實驗表明,早期胚胎暴露于PCBs中會導致出生后發育異常,引起睪丸、附睪、前列腺和精細管損傷,精子質量下降[3].PCBs家族中的許多種類有雌激素作用,能干擾接觸個體或其后代的內分泌功能,導致神經系統、免疫系統、生殖系統障礙[4-5].發育中的組織器官尤其對這類物質敏感,在動物發育的某些關鍵時期,一旦受到這些物質的影響,往往對其生殖系統造成不可逆轉的損害,并具有遺傳性[6].2,2',5,5'-四氯聯苯(PCB 52)是 PCBs中的一種,被認為具有雌激素活性,可干擾動物的內分泌系統[7].

禽類原始生殖細胞(PGCs)是精子和卵子的祖細胞,其遷移伴隨著高速增殖.這些細胞起源于胚胎外胚層,然后經下胚層移動到生殖新月區,最后,這些細胞進入血液循環,在生殖原基附近穿過毛細血管壁定居到生殖原基,在生殖原基分化成精子或者卵子[8].在此過程中數量從幾十個增加到一千多個.

利用禽胚研究環境污染物的影響,一直以來的操作方法是直接將污染物注入到卵黃或者受精卵氣室中.本研究利用禽PGCs遷移路線長(從起源到定居需100多小時),較哺乳動物易于操作的特點,分離發育至14期的雞胚PGCs,用PKH26熒光染料進行標記后做為供體細胞,顯微注射移植到用 PCB 52處理的受體雞胚生殖新月中,然后檢測血液和生殖原基中的外源 PGCs,研究PCB 52對PGCs遷移和增殖的影響.影響動物原始生殖細胞的發育及增殖的環境因素基本相似[9],所以研究環境污染物對禽類 PGCs發育的影響,對揭示一些鳥類尤其是瀕危鳥類數量減少的原因有重要的參考意義.

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

白來航種雞蛋購自中國農業大學養禽場.四氯聯苯(PCB 52)和雌二醇(E2)購自美國Accustandard 公司,溶于二甲基亞砜(DMSO),配成 100mg/mL溶液,-20℃儲存,使用時用最基礎培養基(MEM)稀釋.PKH26試劑盒購自Sigma公司,操作按照試劑盒說明書進行.白消安購于Sigma公司,使用時先用DMSO溶解,然后加入花生油充分乳化(油和 DMSO最終體積比為9:1).Nycodenz 購自Nycomed Pharma AS公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 供體雞胚血液中 PGCs的采集[10]新鮮白來航雞種蛋用 70%的酒精擦拭消毒后在38.5℃,相對濕度 70%,90°/h的轉蛋條件下培養56h左右,使胚胎發育至14期左右,然后用微玻璃針由胚胎血管中抽取含有 PGCs的血液,懸浮于不含血清的 Dulbecco′s MEM(DMEM)培養液中.800×g離心5min棄上清液,加入10μL培養基.

1.2.2 供體雞胚血液細胞PKH26標記 PKH26的標記參照試劑盒說明書進行,簡要步驟如下:1)取細胞數1×107個/μL胚胎血細胞10μL,加試劑盒稀釋液C 200μL,然后加5×10-6mol/L的PKH26 200μL,反復顛倒離心管染色3min;2)加400μL血清,置37℃ 1min使反應停止;3)加800μL含5%血清DMEM, 800×g離心5min,棄上清.重復洗滌3次,每次換新離心管;4)加1mL DMEM重懸.在熒光顯微鏡下確認細胞的標記率及熒光強度.

1.2.3 供體雞胚 PGCs 的 PKH26標記后純化 PGCs的純化參照文獻[11]的方法進行,簡要步驟如下:將上述標記好的細胞 1200×g離心后棄上清,加1mL8% Nycodenz.在5mL離心管中底部加入 1mL12%Nycodenz,中部加 8%血液Nycodenz 混合液,上部加0.2mL 2% Nycodenz溶液.800×g 4℃離心 20min.收集 8%和 12% Nycodenz界面處的細胞各約0.3mL,置于離心管中.加1.4mL DMEM混勻,1200×g 4℃離心5min,重復洗滌 3次.棄上清液,加適量 DMEM,調整PGCs數為大約1000個/μL.

1.2.4 受體雞胚內源性 PGCs的去除 用打孔器在種蛋氣室打一小孔,然后用注射器由氣室將白消安溶液注入卵黃.白消安使用濃度1.0μg/μL.每枚注射體積50μL.石蠟封口后38.5℃, 相對濕度70%, 90°/h的轉蛋條件下孵化.

1.2.5 受體雞胚的E2和PCB 52處理 將上述用白消安處理后的種蛋用牙鉆打一直徑大約5mm的窗孔,用微玻璃針將PCB 52或E2注入到靠近胚盤處,石蠟膜封閉窗口.E2劑量為每個雞胚100μmol/L,PCB 52劑量為每個雞胚10μmol/L,注射體積為每個雞胚1μL.對照分為2組,一組雞胚只注射E2或PCB 52等濃度的DMSO,一組不作任何處理(對照組受體均經過白消安處理).

1.2.6 PKH26標記的供體PGCs注射入處理組受體雞生殖新月區域 將上述PCB 52或E2處理過的受體種蛋在 38.5℃,相對濕度 70%,90°/h的轉蛋條件下培養至8～10期.然后用微注射法把上述標記PGCs 1μL導入受體胚盤生殖新月區域,密封后在相同條件下繼續孵化至 13～15期和27～29期.對照組也注射相同數量的標記PGCs.

1.2.7 注射外源 PGCs后的受體胚胎繼續孵化至13～15期時血液PGCs的采集和計數 待上述移植了標記PGCs的受體雞胚孵化至13～15期時,用鑷子小心打開蛋殼暴露胚胎,實體顯微鏡下以微玻璃針經背主動脈采血 1μL,加入培養液中混勻,800×g離心 5min,棄上清,加入 10μL培養基.取 5μL涂片,熒光顯微鏡下進行 PKH26標記PGCs的計數.PKH26標記細胞在綠光下呈紅色熒光.

1.2.8 注射外源PGCs后的受體雞胚繼續孵化至5.5d時性腺PGCs的分離和計數 待上述移植了標記PGCs的受體雞胚孵化至5.5d,此時雞胚大部分發育至27期.將1對性腺置于含10%胎牛血清(FBS)的 DMEM(冰浴操作)中,然后置于含250μL 0.02% EDTA的PBS于37℃孵育,15min后用針頭輕輕切割性腺.充分切割后的細胞懸液加入1.5mL含20%FBS 的DMEM 450×g離心5min.10μL DMEM重懸.混勻,取 5μL,涂片,熒光顯微鏡觀察計數.

1.3 統計分析

統計分析軟件采用 SPSS 11.5.資料在統計分析前均經SPSS的Explorer分析,數據均呈正態分布且方差相等.各組實驗數據以均值±標準誤表示,顯著性水平設置為α＝0.05.

2 實驗結果

2.1 PCB 52對外源PGCs數量影響

所有受體雞胚注入 PKH26標記的外源PGCs,在外源PGCs沿生殖新月－血液循環－生殖原基遷移的過程中檢測其數量變化.結果表明(表1),PCB 52處理組的PGCs數量明顯低于未處理組及等量DMSO處理組,說明PCB 52可明顯降低外源PGCs的增殖性遷移(P＜0.05).

表1 PCB52對PKH26標記外源PGCs數量的影響Table 1 Effect of PCB52 on proliferative migration of exogenous PGCs labeled PKH26

2.2 E2對外源PGCs數量的影響

為確定PCB 52對雞胚的影響是否其雌激素作用,特設立E2處理組(表2),將PKH26標記的外源PGCs注入上述3組受體生殖新月,區域繼續孵化,檢測13～15期和27～29期的標記PGCs數量變化.結果表明,E2對外源PGCs的增殖性遷移無明顯影響(P＞0.05).

表2 E2對PKH26標記外源PGCs數量的影響Table 2 Effect of E2 on proliferative migration of exogenous PGCs labeled PKH26

3 討論

本實驗中PCB 52的使用劑量采用PCB 52污染地區鳥類體內 PCB 52的濃度[12],以便在實驗室條件條件下模擬自然界PCB 52的污染濃度.以往利用雞胚研究污染物的影響時,通常將污染物注射到卵黃或者受精卵氣室,本實驗緊鄰胚盤導入PCB 52,可使PCB 52立即對PGCs產生影響.因為雞胚是典型的端黃卵,如果將外源物質注入到氣室或者遠離胚胎的其他位置,微量外源物質難以對遷移中的PGCs產生作用.

PCB 52被認為具有雌激素活性[7].在受PCBs污染地區,從食蟲性鳥類(如大山雀)到食肉性猛禽(如埃及禿鷹)體內都可以檢測到 PCB 52[12].盡管體內的PCB 52沒有對成年鳥的健康造成明顯損害,但對其所產卵有明顯影響[12].實驗證明,用PCBs處理未孵化雞胚,對出殼后的雞胚生殖系統可造成明顯損害,影響其卵子和精子的形成[12-15].鳥類PGCs起源于胚胎外胚層,孵化過程中不同發育時期的PGCs均是在此基礎上通過增殖性遷移而來.追蹤不同發育時期的 PGCs數量,就可揭示環境污染物對PGCs的增殖性遷移影響[8].

本課題組以往的實驗證明,PCB 52可明顯降低原條期明區和血液中內源性PGCs的數量,并證明PCB 52對血液中PGCs的影響是由于降低了生殖新月明區PGCs的緣故[10].本實驗通過顯微移植技術,將供體雞胚PGCs用PKH26熒光染料標記,然后移植到經PCB 52處理的受體雞胚,隨后檢測發育至13～15期和27～29期時的PKH26標記的PGCs數量.結果表明,PCB 52可明顯降低外源PGCs在血液和性腺中的數量,說明PCB 52對外源性 PGCs遷移有明顯的阻礙作用.以往實驗[16]和本實驗結果表明,E2對內源性及外源性PGCs的增殖性遷移均無影響.E2對內源和外源PGCs的增殖性遷移無明顯影響的機制是否與PGCs膜上的受體表達有關,或PGCs膜上受體表達的時空性等問題還有待于進一步探討.E2對PGCs的遷移無明顯影響,揭示PCB 52可能影響的是受體性腺的誘引物質,且這種影響是非雌激素作用.

由于內源性 PGCs的消除可明顯提高外源性PGCs移植效率,所以在本實驗中除了用PCB 52和E2處理受體雞胚外,還用白消安進行了受體的處理.Song等[17]的研究表明,用白消安處理雞胚盤,能明顯降低內源性的PGCs數量,但對白消安處理雞胚繼續孵化20多個小時后注入的外源性PGCs的增殖性遷移無明顯影響.

本實驗所用的PKH26可有選擇地嵌入細胞膜脂質層從而細胞被染色.PKH26從細胞溶出的半衰期是100d以上(體內),這種特性使得PKH26在生物體內的跟蹤研究細胞時與其他標記物相比,具很大優勢.在本實驗中,通過PKH26的跟蹤研究,發現PCB 52可明顯降低外源PGCs的在血液循環中和生殖原基中的數量,這表明 PCB 52在雞胚體內的半衰期很長,對細胞的毒性影響最少持續100多小時,對胚胎的原始生殖細胞可造成長久的有害影響.

4 結論

4.1 本實驗表明, PCB 52對外源性PGCs的增殖性遷移有明顯影響.

4.2 E2對外源性PGCs的增殖性遷移無明顯影響.

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