生物抑菌劑抑制大腸埃希菌效果研究

黃現青,高曉平,趙改名,史 超,李苗云,柳艷霞,張秋會,孫靈霞

(河南農業大學食品科技學院,河南鄭州 450002)

大腸埃希菌(Escherichia coli)廣泛分布于自然界,主要寄居于人及動物的腸道,是一種條件性致病菌。在食品衛生中,大腸埃希菌作為指示菌,根據食品中大腸埃希菌的有無來間接地判定食品被糞便污染的可能程度[1]。大腸埃希菌是人和許多動物腸道中最主要且數量最多的一種細菌。它侵入人體一些部位時,可引起感染,如腹膜炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等。人在感染大腸埃希菌后的癥狀為胃痛、嘔吐、腹瀉和發熱。感染可能是致命性的,尤其是對孩子及老人[2]。大腸埃希菌對食品的污染嚴重危害著人們的食品安全與健康。在對食品安全愈加重視的當今社會,由于化學防腐劑的安全性受到挑戰,天然食品防腐劑備受青睞。開發廣譜、高效、安全的天然食品防腐劑,具有重要的現實意義。乳酸鏈球菌素(Nisin)、ε-聚賴氨酸和殼聚糖在食品防腐方面具有很好的殺菌效果,能夠有效抑制細菌的生長繁殖,延長食品保質期,是更加安全可靠的新一代食品防腐劑[3-5]。本實驗的研究有望通過應用生物防腐劑對大腸埃希菌進行控制和殺滅,減少其對人體的危害以及在食品中的存活數量,提高人們的食品安全水平,保障人們的飲食健康。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 大腸埃希菌(Escherichia colis)AS1.487株,購于中國科學院微生物所;

1.1.2 培養基 ①LB液體培養基(%)：牛肉膏0.5,蛋白胨1,NaCl 0.5,pH 7.2;②LB固體培養基(%)：牛肉膏0.5,蛋白胨1,NaCl 0.5,瓊脂1.5,pH 7.2。

1.1.3 防腐劑 Nisin、ε-聚賴氨酸、殼聚糖,分別購自洛陽市華健生物工程有限公司、浙江銀象生物有限公司、山東濰坊海之源生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與培養 將大腸埃希菌菌種接種于LB試管斜面培養基上,37℃培養24 h,將菌種活化。菌種經活化后,接入LB液體培養基,37℃、150 r/min振蕩培養。

1.2.2 最小抑菌濃度測定 取經16～18 h增菌培養的大腸埃希菌菌液100μL和1 mL LB液體培養基于試管中,加入防腐劑倍比稀釋,共稀釋12次,于37℃、150 r/min培養18～20 h后觀察并經比色測定大腸埃希菌的生長情況,以大腸埃希菌不生長的稀釋度為最小抑菌濃度(M I C)。

1.2.3 殺菌動力學 將經過培養的大腸埃希菌菌液于1 500 r/min離心10 min,棄上清液,用50 mL無菌水收集菌液。取制備的大腸埃希菌細胞懸液分裝于12個試管中,每個試管5 mL菌液,向其中一組加5 mL無菌水作為空白,取其他3組試管加入抑菌劑5 mL,使試管中抑菌劑濃度為1 M IC,置于4℃冰箱中放置。空白在0 h取樣倒平板,其余的分別在3、6、9 h取樣倒平板,將平皿置于37℃恒溫培養箱中培養,24 h后取出,菌落計數。

1.2.4 滅活優化實驗 將培養16～18 h的大腸埃希菌菌液100 mL于1 500 r/min離心10 min,棄上清液,用100 mL蒸餾水收集菌液,將菌液分裝于9組試管,每個試管0.5 mL,然后按正交表設計添加防腐劑用量,使其最終濃度為正交表中各水平濃度,最后用無菌水補足10 mL,同時設空白對照組,見表1。將試管于4℃冰箱中放置24 h后,每支試管取出0.1 mL,稀釋6個梯度,倒平板計數。

表1 正交試驗因素與水平L9(33)Table 1 Orthogonal factors and the level

1.2.5 應用試驗 取50 mL大腸埃希菌菌液于1 500 r/min離心10 min,棄上清液,用50 mL無菌水收集菌液。取2組試管,一組加3種抑菌劑的最佳配比(由正交實驗得出),再加0.5 mL菌液,用美汁源果粒橙補足10 mL。另一組只加0.5 mL菌液,用牛奶補足10 mL。將試管放入冰箱中48 h,然后倒平板并計數,計算殺菌率[6]。

2 結果與分析

2.1 最小抑菌濃度

用液體倍比稀釋法測定M IC,測定結果顯示,殼聚糖、ε-聚賴氨酸、Nisin的M I C分別為10、2.5、0.078 mg/mL。

2.2 殺菌動力學

通過平板計數法測定殼聚糖、ε-聚賴氨酸、Nisin對大腸埃希菌的殺菌動力學,結果見圖1。由圖1可以看出,殼聚糖組對菌落總數沒有影響;Nisin組效果比較明顯,菌落對數曲線明顯下降,3 h后下降趨于平緩;ε-聚賴氨酸組的菌落對數曲線下降明顯,3 h后效果減弱。結果表明,Nisin和ε-聚賴氨酸對大腸埃希菌的殺滅效果較明顯,而殼聚糖對大腸埃希菌幾乎沒有殺滅作用。

2.3 滅活優化實驗(正交法)

按L9(33)正交表設計添加防腐劑用量,優化殺滅大腸埃希菌效果,結果見表2。由表2可知,Nisin的極差最大,對大腸埃希菌的抑制效果起主要影響作用,最佳處理組合：Nisin、ε-聚賴氨酸、殼聚糖的濃度分別為0.04、0.01、5 mg/mL。

圖1 Nisin、ε-聚賴氨酸和殼聚糖的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect ofNisin、ε-poly-L-lysine and chitosan

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

2.4 應用實驗

由于在不同的介質中可能會影響防腐劑的抑菌效果,以果粒橙為介質研究了復合Nisin、ε-聚賴氨酸、殼聚糖應用效果實驗,顯示其殺菌率可達88.57%,3種抑菌劑的最佳組合對大腸埃希菌有明顯的殺滅作用。

3 結 論

研究結果表明,殼聚糖、Nisin、ε-聚賴氨酸的最小抑菌濃度分別為10、2.5、0.078 mg/mL。當殼聚糖、Nisin、ε-聚賴氨酸的濃度分別為5、0.04、0.01 mg/mL時對大腸埃希菌的抑制作用最好,在這一最佳組合條件下對鮮乳介質中的大腸埃希菌殺菌率達88.57%。

[1] 徐曉可,吳清平,周艷紅,等.肉類中大腸埃希菌O157：H7多重PCR檢測方法的建立[J].微生物學通報,2008,35(4)：619-622

[2] 何國慶,賈英民.食品微生物學[M].北京：中國農業大學出版社,2002：384-387.

[3] 蔣士龍.幾種化學防腐劑的安全性及鑒別方法[J].肉類工業,2007,(11)：38-39.

[4] Belewu,M.A.,Belewu,K.Y.Nk wunonwo,C.C.Effect of biological and chemical preservatives on the shelf life of West African soft cheese[J].African Journal of Biotechnology,2005,4(10)：1076-1079.

[5] 高兆銀,李敏,胡美姣,等.殼聚糖涂膜對香蕉保鮮生理和防腐效果初步研究[J].浙江農業科學,2007,3：278-280.

[6] Magnusson M,Svensson,B.Svensson.Bacillus cereus Spores During Housing of Dairy Cows：Factors Affecting Contamination of Raw Milk[J].Journal of Dairy Science,2007,90(6)：2745-2754.