枇杷果醋載體吸附式醋化技術(shù)研究

李維新, 何志剛, 林曉姿, 任香蕓

(1.福建省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心,福建福州 350013;2.福建省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所,福建 福州 350003)

枇杷果醋載體吸附式醋化技術(shù)研究

李維新1,2, 何志剛1,2, 林曉姿1,2, 任香蕓1,2

(1.福建省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心,福建福州 350013;2.福建省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所,福建 福州 350003)

以枇杷果酒為原料,玉米芯為醋酸菌載體,分析了醋酸發(fā)酵過程中載體和發(fā)酵液內(nèi)醋酸菌量與醋酸產(chǎn)量的變化,研究了底物、產(chǎn)物濃度及供氣模式對(duì)枇杷酒醋化的影響。結(jié)果表明:枇杷果醋發(fā)酵基質(zhì)中初始乙醇體積分?jǐn)?shù)以5%～7%較為合適;體積分?jǐn)?shù)1%的醋酸作為底酸,對(duì)醋酸發(fā)酵起到促進(jìn)作用;載體具有吸附醋酸菌的作用,醋酸發(fā)酵主要是在載體上進(jìn)行;采取分段供氣和變頻噴淋工藝,使體積分?jǐn)?shù)7%乙醇含量的枇杷酒醋酸轉(zhuǎn)化率達(dá)79.7%,比其它供氣模式高約3個(gè)百分點(diǎn),比無載體發(fā)酵高12個(gè)百分點(diǎn)。

枇杷果醋;載體吸附;醋酸發(fā)酵;工藝技術(shù)

水果中具有豐富的糖質(zhì)資源,是釀酒和釀醋用的上等原料[1-2],目前食醋不斷向保健型轉(zhuǎn)變已成為趨勢(shì),果醋作為一種具有良好風(fēng)味的保健醋而倍受消費(fèi)者歡迎。

釀造食醋的工藝有固態(tài)和液體發(fā)酵法,液體發(fā)酵因具有便于機(jī)械化、發(fā)酵周期短、勞動(dòng)生產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)而發(fā)展迅速,尤其是固定化醋酸發(fā)酵工藝的應(yīng)用,大大提高了醋酸發(fā)酵的效率;固定化醋酸發(fā)酵中載體吸附式是采用玉米芯等具有多孔狀纖維材料來吸附醋酸菌,從而達(dá)到固定菌體細(xì)胞的目的,此方法具有菌體密度高、反應(yīng)速率快、穩(wěn)定性好、使用壽命長(zhǎng)、可重復(fù)利用、便于產(chǎn)物的分離等優(yōu)點(diǎn)[3-4],但也存在容易過度氧化,果醋口感淡薄等缺點(diǎn)。醋酸菌是一個(gè)好氧菌,在其醋化乙醇過程中需要消耗大量的氧氣,在醋酸發(fā)酵過程中必須不斷通入空氣,以便給醋酸菌供氧。在醋化過程,通氣量過大或不足,將導(dǎo)致酒精損耗增加或發(fā)酵周期延長(zhǎng),而導(dǎo)致乙酸轉(zhuǎn)化率下降[5]。因此,在枇杷酒醋化過程,通過增加發(fā)酵初期的菌體數(shù)量、控制通氣量、噴淋頻率等工藝參數(shù)對(duì)縮短發(fā)酵周期,減少乙醇損耗,提高乙酸轉(zhuǎn)化率至關(guān)重要。目前國內(nèi)外對(duì)蘋果醋、柑橘醋等工藝技術(shù)的研究較多[6-7],對(duì)枇杷果醋釀造技術(shù)的研究較少[8],采用載體吸附式醋化技術(shù)釀造枇杷果醋,并對(duì)發(fā)酵工藝技術(shù)和參數(shù)進(jìn)行研究還未見相關(guān)報(bào)道;作者以枇杷果酒為原料,以玉米芯為醋酸菌細(xì)胞吸附載體,分析了載體吸附式醋酸發(fā)酵過程載體和基質(zhì)中菌量與醋酸產(chǎn)量的變化,研究了初始底物、產(chǎn)物濃度及供氣模式對(duì)枇杷酒醋化周期及乙酸轉(zhuǎn)化率的影響,提出枇杷果醋載體吸附式醋化技術(shù),為枇杷酒的醋化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 枇杷酒為枇杷經(jīng)過破碎、榨汁、酒精發(fā)酵釀造,乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%和7%兩種,酸度為0.29%(醋酸體積分?jǐn)?shù)),殘?zhí)琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%;玉米芯,市場(chǎng)購買,曬干備用;無水乙醇、冰乙酸均為分析純。

1.1.2 菌種 醋酸菌為巴氏醋桿菌巴氏亞種(Acetobacter pasteurianus subsp.Pasteurianus)(滬釀1.01),由上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司提供。

1.1.3 種子培養(yǎng)基 葡萄糖1 g,酵母膏1.5 g,磷酸二氫鉀 0.05 g,硫酸鎂 0.05 g,水 100 mL,p H 6.5,滅菌后冷至60℃以下加入無水乙醇3.5 m L。

1.1.4 儀器與試劑 B IOTECH-5BG:上海保興生物設(shè)備工程有限公司產(chǎn)品,p H100生物顯微鏡:鳳凰光學(xué)控股有限公司產(chǎn)品;載體吸附式醋酸發(fā)酵罐,80L(自制),可自動(dòng)控溫和噴淋,自吸泵的流量為10 L/min;HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品;250 m L三角瓶,燒杯等。NaOH,乙酸等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 醋酸菌種子培養(yǎng) 將滬釀1.01接種于種子培養(yǎng)基,置于全溫振蕩培養(yǎng)箱中,32℃、150 r/m in,培養(yǎng)30 h,醋酸菌種子菌量為2×108個(gè)/m L。種子培養(yǎng)后,繼續(xù)接種于乙醇體積分?jǐn)?shù)5%的枇杷酒中,于自動(dòng)玻璃發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng),待醋酸菌量達(dá)到108級(jí)別后,作為載體發(fā)酵的種子備用。

1.2.2 初始底物、產(chǎn)物濃度對(duì)醋化的影響 經(jīng)巴氏殺菌含乙醇體積分?jǐn)?shù)5%的枇杷果酒,用無水乙醇分別調(diào)配成乙醇體積分?jǐn)?shù)5%～10%的發(fā)酵基料,每瓶100 mL,共6個(gè)處理;乙醇為體積分?jǐn)?shù)5%的枇杷果酒,分別添加 0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的冰乙酸 ,每瓶100 m L,共 7 個(gè)處理;上述13個(gè)處理分別裝于250 mL的三角瓶中,接入10 m L已培養(yǎng)好的醋酸菌液,單層紗布封口,置于全溫振蕩培養(yǎng)箱,32℃,150 r/m in培養(yǎng),每24 h測(cè)定總酸,計(jì)算酸的凈增量,實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 載體和基質(zhì)中菌量與乙酸產(chǎn)量的關(guān)系 初發(fā)酵與載體菌體細(xì)胞富集:在醋酸發(fā)酵罐的上部,分3層裝入載體(玉米芯)10 kg,下部裝入30 kg體積分?jǐn)?shù)7%的枇杷酒;接入3 L經(jīng)過預(yù)先擴(kuò)大培養(yǎng)的醋酸菌液,設(shè)定發(fā)酵溫度為30～32℃,通氣量為0.8 L/(min·kg),噴淋周期設(shè)為停20 min淋20 m in;循環(huán)噴淋30 m in后開始計(jì)時(shí),每3 h測(cè)定一次發(fā)酵液的總酸,12 h測(cè)定一次發(fā)酵液及載體中的醋酸菌個(gè)數(shù)。

第二批次發(fā)酵:經(jīng)初發(fā)酵完畢、完成載體菌體細(xì)胞富集后,重新接入新的枇杷酒液50 L,發(fā)酵條件不變,循環(huán)噴淋30 min后開始計(jì)時(shí),每3 h測(cè)定一次發(fā)酵液的總酸,12 h測(cè)定一次發(fā)酵液及載體中的醋酸菌個(gè)數(shù)。

1.2.4 供氣噴淋模式研究 采用以下A、B、C 3種供氣模式進(jìn)行載體吸附式醋化枇杷酒,發(fā)酵開始時(shí)載體已經(jīng)經(jīng)過醋酸菌的富集。枇杷酒的體積分?jǐn)?shù)7%,酸度為體積分?jǐn)?shù)0.29%,發(fā)酵溫度控制在30～32℃,每12 h測(cè)定一次基質(zhì)總酸體積分?jǐn)?shù),發(fā)酵結(jié)束后,統(tǒng)計(jì)乙酸轉(zhuǎn)化率,以無載體恒定供氣和連續(xù)噴淋液體發(fā)酵作為對(duì)照。

處理A:分段供氣和變頻噴淋 供氣分為3段:0～12 h,12～48 h,48 h以后,其通氣量分別為0.2、0.8、0.2 L/(min·kg),變頻噴淋周期分別為停20 min淋 5 min、停 5 min淋 20 min、停 20 min 淋 5 m in;處理B:恒定供氣和間歇噴淋 通氣量為0.8 L/(min·kg),噴淋周期為停20 min淋20 min;處理C:恒定供氣和連續(xù)噴淋 通氣量為0.8 L/(min·kg)。

1.2.5 測(cè)定方法 總酸:0.05 mol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定法,以醋酸表示;酒度:按 GB10345.3—89標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定;基質(zhì)中醋酸菌計(jì)數(shù):血球計(jì)數(shù)法;載體中醋酸菌計(jì)數(shù):從發(fā)酵載體的上、中、下不同部位取3～5 g的玉米芯,剪碎置于100 mL的無菌水中在搖床振蕩30分鐘,取樣計(jì)數(shù),換算成玉米芯所含菌數(shù)(個(gè)/g)。乙酸轉(zhuǎn)化率的計(jì)算參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始底物濃度與產(chǎn)酸量的關(guān)系

滬釀1.01醋酸菌對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)在10%以內(nèi)的枇杷酒樣都能起動(dòng)醋化,但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)提高,低產(chǎn)酸量維持的時(shí)間變長(zhǎng),醋酸菌生長(zhǎng)的延滯期延長(zhǎng)。乙醇體積分?jǐn)?shù)在5%～7%時(shí),各處理之間產(chǎn)酸量變化差異不明顯,但都高于乙醇體積分?jǐn)?shù)大于8%的各處理(圖1)。分析醋化168 h后總產(chǎn)酸量(Y)與初始乙醇含量(X)間的關(guān)系為:Y=4.474-0.221X(P<0.01),隨著初始乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,總產(chǎn)酸量反而降低,這表明高乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)醋酸菌的生長(zhǎng)具有抑制作用,使得醋酸菌的延滯期延長(zhǎng)。這種結(jié)果必然導(dǎo)致高體積分?jǐn)?shù)的乙醇醋化的周期延長(zhǎng),乙醇損耗增加,乙酸轉(zhuǎn)化率下降,因此試驗(yàn)認(rèn)為:枇杷酒的醋化應(yīng)以乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%～7%較為合適。

圖1 底物體積分?jǐn)?shù)對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on acetic acid fermentation

2.2 初始產(chǎn)物體積分?jǐn)?shù)與產(chǎn)酸量的關(guān)系

由圖2可知,當(dāng)初始添加的乙酸體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí),接種后72 h內(nèi)的產(chǎn)酸量呈直線上升,產(chǎn)酸率高于含對(duì)照組在內(nèi)的各處理組;初始乙酸體積分?jǐn)?shù)為0.5%和1.5%的處理與對(duì)照組間無明顯差異,當(dāng)乙酸添體積分?jǐn)?shù)大于1.5%時(shí),表現(xiàn)出抑制作用,接種初期不產(chǎn)酸,且初始乙酸體積分?jǐn)?shù)越高,醋化延滯越長(zhǎng),乙酸的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到3%時(shí),醋化延滯期達(dá)96 h。結(jié)果表明:在醋酸發(fā)酵過程中,保留適量的乙酸作為底酸,對(duì)醋酸發(fā)酵起到促進(jìn)作用,其最佳含量為1%。

圖2 乙酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of acetic acid concentration on acetic acid fermentation

2.3 載體和基質(zhì)中菌量與醋酸產(chǎn)量的變化

從菌量看,初次發(fā)酵載體與發(fā)酵液中的菌量都有一個(gè)緩慢增長(zhǎng)期,作為載體的玉米芯中含有大量的醋酸菌(含量用c表示,單位為個(gè)/g),12 h后就達(dá)到在108個(gè)/g以上,而液體中的醋酸菌含量較少,僅在107個(gè)/g水平上;醋酸菌富集后的固定化發(fā)酵(第2批),載體中因初次發(fā)酵的富集作用而始終保持在高菌量水平上,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于液體中的含量,說明載體具有富集醋酸菌的作用,醋酸發(fā)酵主要是在載體上進(jìn)行的(圖3、5)。從醋酸總量變化看,初次發(fā)酵的醋化緩沖期較長(zhǎng)(24 h),在此期間,醋酸增量只有0.21%;之后才進(jìn)入快速產(chǎn)酸期,整個(gè)發(fā)酵周期為72 h(圖4);在醋酸菌富集后的第二批發(fā)酵中,通過初次發(fā)酵后載體中的菌量已達(dá)到高菌量水平,從而縮短了低菌量的醋酸菌繁殖期;發(fā)酵開始后,經(jīng)噴淋交換使基質(zhì)中含有1.0%左右醋酸作為底酸,也能促進(jìn)了醋化作用的進(jìn)行;因此,第二批醋化緩沖期不明顯,接種后即開始產(chǎn)酸,12 h內(nèi)醋酸增量達(dá)到0.9%,產(chǎn)酸高峰期為12～48 h,發(fā)酵周期為57 h(圖6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,載體具有吸附醋酸菌的作用,醋化主要在載體上進(jìn)行;載體富集醋酸菌后能迅速啟動(dòng)醋酸發(fā)酵,從而縮短發(fā)酵周期,提高產(chǎn)酸率。

2.4 供氣噴淋模式對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

載體吸附式醋酸發(fā)酵,具有有較高的產(chǎn)酸率,發(fā)酵周期短(57 h),乙酸轉(zhuǎn)化率高,均達(dá)76%以上;而無載體液體發(fā)酵工藝(CK)接種后,低產(chǎn)酸期長(zhǎng)達(dá)24 h,整個(gè)發(fā)酵過程中產(chǎn)酸率低,發(fā)酵周期長(zhǎng)(96 h),因長(zhǎng)時(shí)間的噴淋和通氣,致使乙醇的損耗量大,最終其乙酸轉(zhuǎn)化率較低,只有67.24%(圖7、表1)。

圖3 初次發(fā)酵載體與發(fā)酵液中菌量的變化Fig.3 Acctobactor quantity change in carriors and liquid during first fermentation

圖4 初次載體發(fā)酵中總酸的變化Fig.4 Total acid change during firse carrior fermentation

圖5 第二批發(fā)酵載體及發(fā)酵液菌量變化Fig.5 Acctobacter quantity change in carriors and liquid during next fermentaion

圖6 第二批發(fā)酵中總酸的變化Fig.6 Total acid change duing next fenmentaion

圖7 發(fā)酵方式對(duì)產(chǎn)酸量的影響Fig.7 Effect of fermentation model on the yield of acetic acid

表1 通氣量及噴淋頻率對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Tab.1 Effects of ventilation quantity and insufflation frequency on acetic acid fermentation

載體吸附式醋酸發(fā)酵前期,醋酸菌產(chǎn)酸率較低,耗氧水平也低;但此時(shí)期發(fā)酵液中乙醇濃度高,高通氣和連續(xù)噴淋會(huì)加大乙醇的損耗。分段供氣和變頻噴淋工藝(A)同另兩種供氣方式(B、C)相比,因其前期通氣量小,乙醇的損耗也相應(yīng)減少;接種后12 h內(nèi)產(chǎn)酸少,但其高產(chǎn)酸期(12～48 h)產(chǎn)酸速率高,最終的產(chǎn)酸量也高(圖7);3種供氣方式的發(fā)酵周期均為57 h,但A方式的乙酸的轉(zhuǎn)化率比B、C提高了約3個(gè)百分點(diǎn)(表2)。同時(shí)因通氣和噴淋得到控制,A方式能縮短了電機(jī)的工作時(shí)間,既延長(zhǎng)了機(jī)器的使用壽命,又節(jié)約了能源,因此生產(chǎn)上應(yīng)采取控制通氣及噴淋的方法,既能提高產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率,又可降低生產(chǎn)成本。

3 討論與結(jié)論

1)在醋酸發(fā)酵中,醋酸菌要經(jīng)歷利用發(fā)酵基質(zhì)中的營養(yǎng)成份繁殖生長(zhǎng),同時(shí)將乙醇氧化成醋酸兩個(gè)過程。醋酸發(fā)酵過程存在高濃度乙醇的底物抑制和高濃度醋酸的產(chǎn)物抑制效應(yīng)[9]。高濃度的乙醇對(duì)醋酸菌的繁殖具有顯著的抑制作用,發(fā)酵基質(zhì)中乙醇含量越高,其抑制作用越明顯;同時(shí)乙醇濃度過高,抑制醋酸菌的生長(zhǎng),致使其發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),乙醇的揮發(fā)損失加大,產(chǎn)酸率會(huì)降低。綜合考慮認(rèn)為枇杷果醋發(fā)酵時(shí),乙醇體積分?jǐn)?shù)以5%～7%較為合適。

乙酸是醋酸發(fā)酵的產(chǎn)物,在載體吸附式醋酸發(fā)酵的連續(xù)生產(chǎn)中,因載體的吸附作用,下批次的發(fā)酵液中會(huì)滯留有一定量的乙酸,其含量的高低會(huì)對(duì)醋酸的發(fā)酵作用造成一定的影響。王麗麗等在醋酸菌生長(zhǎng)的營養(yǎng)需求及產(chǎn)酸的促進(jìn)作用研究中發(fā)現(xiàn),發(fā)酵培養(yǎng)基外加體積分?jǐn)?shù)1%～2%的醋酸作為底酸對(duì)滬釀1.01的產(chǎn)酸速率有促進(jìn)作用[10]。作者研究表明,在枇杷果醋發(fā)酵中,高濃度的乙酸對(duì)醋酸發(fā)酵有明顯的抑制作用,但一定含量的乙酸作為底酸,可對(duì)發(fā)酵起到促進(jìn)作用,醋酸發(fā)酵時(shí)其體積分?jǐn)?shù)以1%較為合適,此結(jié)論與王麗麗等的研究基本一致。

2)載體吸附式醋酸發(fā)酵中,玉米芯載體中含有大量的醋酸菌,而液體中的醋酸菌含量較少,表明載體具有富集醋酸菌的作用,醋酸發(fā)酵主要是在載體上進(jìn)行的,而液體中幾乎沒有發(fā)酵作用,因?yàn)榇姿峋哂挟a(chǎn)酸能力時(shí)液體菌數(shù)必須達(dá)到108級(jí)以上。在第二批次的醋酸發(fā)酵中,通過初次發(fā)酵后載體中的菌量已達(dá)到高菌量水平,從而縮短了低菌量的醋酸菌繁殖期,從而可縮短發(fā)酵周期,提高醋酸轉(zhuǎn)化率。

3)乙醇和乙酸作為醋酸發(fā)酵底物和產(chǎn)物具有很強(qiáng)的揮發(fā)性,通氣量及通氣時(shí)間均會(huì)影響乙醇和乙酸的損耗速度。在載體吸附式醋酸發(fā)酵過程中由于發(fā)酵液的噴淋作用,增大了乙醇、乙酸與空氣的接觸面積,其因通氣的損耗量會(huì)增加;在發(fā)酵前期,基質(zhì)中乙醇濃度高,高通氣和連續(xù)噴淋會(huì)加大乙醇的損耗,此時(shí)期醋酸菌處于繁殖階段,耗氧較低,因此前期應(yīng)減少通氣量;在中期,醋酸菌處于高產(chǎn)酸期,發(fā)酵速度快,耗氧量大,此時(shí)應(yīng)加大通氣量;發(fā)酵后期如通入的氧氣過量,在乙醇含量不足的情況下,會(huì)發(fā)生過氧化反應(yīng),醋酸菌將乙酸進(jìn)一步氧化成水和二氧化碳,使酸度迅速下降,吸附醋酸載體物質(zhì)的溫度就會(huì)迅速上升,為雜菌的大量繁殖創(chuàng)造了條件,大量雜菌生長(zhǎng)就會(huì)使醋汁產(chǎn)生異味、變混濁,故在發(fā)酵的后期也應(yīng)減少通氣量。因此,采取分段供氣及變頻噴淋的方法,能提高產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率,7%乙醇體積分?jǐn)?shù)的枇杷酒醋酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)到79.7%,比其它供氣模式高出約3個(gè)百分點(diǎn),比無載體發(fā)酵高出12個(gè)百分點(diǎn)。

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Study on Loquat Vinegar Acetification Technique with Carrier Adsorption

L IWei-xin1,2, HE Zhi-gang1,2, LIN Xiao-zi1,2, REN Xiang-yun1,2
(1.Agricultural Products Process Research Centre,Fujian Academy of Agricultrual Science,Fuzhou 350013,China;2.Institute of Agricultural Engineering Technology,Fujian Academy of Agricultrual Science,Fuzhou 350003,China)

This manuscript study the relationship between acetobacter biomass and the amount of acetic acid production in a carrier adsorption fermentation with comcobs as carriers.A series of optimum process parameters were achieved and listed as follow s:(1)the initial ethanol content is 5-7%;(2)the content of substrate(acetic acid)is 1%;(3)The carriers could absorb the acetobacter and it is the place of acetification;(4)The combination of phase gas-offering and alterable frequency insufflation could imp rove the acetic acid conversion rate 3%(compared with that of gas-offering models)and 12%(that of non-carriers fermentation),respectively.

Loquat vinegar,carriers adsorption,acetic acid fermentation,technology

TS 255.44

A

1673-1689(2010)02-0206-05

2009-04-18

福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2006S0008);福建省財(cái)政專項(xiàng)—福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)基金資助(STIF-Y05)。

李維新(1970-),男,河南新縣人,副研究員,主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。Email:lw x406@163.com。

＊通信作者：何志剛(1964-),男,福建莆田人,研究員,主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。Email:njgzx@163.com。

(責(zé)任編輯:朱明)