腫瘤壞死因子-α和白介素-2對成骨細胞增殖的影響

薛 明,楊 諦,李 任

(中國醫科大學口腔醫學院牙體牙髓科,遼寧沈陽 110002)

骨組織吸收是根尖周病變和牙周病變中一個重要的病理改變,其治療的最終目的是誘導成骨細胞增殖,分泌基質從而礦化為骨組織,使缺失的牙槽骨重建。成骨細胞的增殖受多種因素相互作用的影響,包括激素、細胞因子和局部生長因子等,這些因素的存在能夠影響骨組織的形成和礦化[1]。本實驗研究白介素-2(Interleukin-2, IL-2)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)對成骨細胞增殖的影響,探討影響成骨細胞增殖的病理機制。

1 材料與方法

1.1 材料

MG63人骨肉瘤細胞系(中國細胞庫典藏細

胞中心);DMEM培養基(Gibco,美國);胎牛血清(天津灝洋生物制品);胰蛋白酶(Amresco,美國);白介素-2(長春長生基因,20萬國際單位/支,批號20070806);腫瘤壞死因子-α(上海賽達生物藥業,500萬國際單位/瓶,批號20090612)。

1.2 方法

1.2.1 MG63細胞的培養 從液氮中取出凍存的MG-63細胞,迅速放入37℃溫水中,輕輕搖動凍存管令其內容物盡快融化。用吸管吸出細胞懸液至離心管,加入新鮮培養基10 mL,輕吹懸浮細胞,1 000 r/min離心5 min,去上清,再用培養液重復洗1次。將MG-63細胞以5×105個/mL密度接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中,置于含5%CO2、37℃、飽和濕度的二氧化碳培養箱中培養,24 h后換液1次。當細胞生長狀態良好,至覆蓋培養瓶底80%時,以0.25%胰蛋白酶消化,進行傳代。

1.2.2 細胞增殖的測定 取生長狀態良好、幾乎長滿瓶底的MG63細胞進行傳代,制備成濃度為1×105個/mL的細胞懸液,接種于96孔培養板,分為1個對照組和12個實驗組,每組設4個復孔,每孔100μL。37℃、5 mL/L CO2培養箱培養24 h。實驗組分別加入100μL終濃度為5、10、50、100、500、1 000 U/mL的 IL-2和TNF-α,對照組加入等體積的DMEM培養基,繼續培養48 h。各孔加入MTT 10μL,繼續培養4 h。吸出培養液,每孔各加入二甲基亞砜100μL,作用10 min后,酶聯免疫檢測儀測定各孔的吸光度值(A570nm)。

1.2.3 統計學處理 應用SPSS11.0軟件包對實驗數據進行統計學分析,組間比較采用單因素方差分析,實驗組與對照組比較采用Dunnett-t檢驗。

2 結 果

隨著 IL-2劑量的增加,各組細胞出現不同程度的增殖,以 IL-2濃度為100、500、1 000 U/mL組增殖明顯,與未加藥物的對照組比較,有統計學差異(P＜0.05)。50～1 000 U/mL的TNF-α對成骨細胞的增殖也有促進作用(P＜0.05),這種促進作用的峰值在100 U/mL,見表1、圖1。

表1 各組成骨細胞的平均吸光度值(A570nm)Table 1 The mean absorbency values of osteoblasts(A570nm)

圖1 不同濃度I L-2和TNF-α對成骨細胞增殖的影響Fig.1 The effect of I L-2 and TNF-αon the proliferation of osteoblasts

3 討 論

骨組織的形成需要經過間充質干細胞、骨原細胞、成骨細胞、骨細胞等一系列細胞的增殖、分化。成骨細胞作為骨形成細胞,在成骨過程中經歷分裂增殖、分化成熟和基質鈣化3個階段。研究表明,很多細胞因子參與調節成骨細胞的增殖活動,如白介素-1(Interleukin-1, IL-1)、白介素6(Interleukin-6, IL-6)、轉化生長因子β1(Transforming growth factorβ1,TGFβ1)以及成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor,FGF)等[2-3]。 IL-2是體內一種重要的參與免疫調節的細胞因子,目前的研究認為其主要生物學作用是促進T細胞增殖;維護整個NK細胞的活化、分化和增殖,調節NK細胞保持其自然殺傷力;誘導細胞毒性T淋巴細胞產生和增殖;誘導淋巴因子活化淋巴細胞產生;促進B細胞增殖分化作用;以及與其他白介素等的協同作用,用于抗腫瘤、抗病毒感染、抗細菌感染以及提高免疫力的治療等[4]。 IL-2對成骨細胞增殖的影響研究較少,Reyes-Botella等[5]檢測到成骨細胞表達 IL-2受體和CD25分子,推測 IL-2對成骨細胞的行為可能存在影響。本實驗將不同濃度的 IL-2作用于MG63細胞后,觀察到 IL-2能夠促進成骨細胞增殖,隨著 IL-2濃度的增加,這種促進增殖作用呈上升趨勢,提示IL-2是成骨細胞的一種促分裂原,推測 IL-2通過促進成骨細胞增殖,參與骨吸收疾病的骨組織重建過程。

在骨組織改建過程中,成骨細胞不僅參與成骨過程,也參與破骨細胞的骨吸收過程,是骨代謝的主要功能細胞[6]。骨組織改建受多種細胞因子的調節,其中TNF-α被認為是一種十分重要的破骨細胞激活因子,能夠刺激前祖細胞分化為破骨細胞,并能夠間接刺激成熟的破骨細胞形成骨吸收陷窩,導致破骨細胞的骨吸收增強[7]。在正常人體液中,TNF-α的水平一般在100 ng/L,在婦女絕經后骨質疏松病例以及2型糖尿病骨質疏松病例中,TNF-α的水平有所升高,這些均提示TNF-α是促進骨吸收的動因[8-9]。關于TNF-α對成骨細胞的作用,目前研究主要集中在TNF-α能夠促進成骨細胞的凋亡[10]以及產生骨吸收因子前列腺素-2(Prostaglandin E2,PGE2)、白介素-6(Interleukin-6, IL-6)[11]等方面。本試驗將小劑量的TNF-α作用于成骨細胞,觀測到其對成骨細胞的促進增殖作用,并且隨著TNF-α濃度的增加,這種促進作用逐漸削弱。推測低濃度的TNF-α通過增加成骨細胞的數量,產生炎癥因子,參與破骨過程,而高濃度的TNF-α則通過直接誘導成骨細胞凋亡,促進骨吸收。通過對骨組織改建過程中細胞因子作用的探討,可以為人為干預骨組織改建提供方向,從而提高炎性骨吸收疾病的治療水平。

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