1株產(chǎn)漆酶白腐真菌的篩選和鑒定

關(guān)艷麗,李 莉,陳 飛,郭玲玲,華 霜,孫立梅

(1.遼寧省微生物科學(xué)研究院,遼寧朝陽 122000;2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院,遼寧沈陽 110161)

白腐真菌(white rot fungi)是一類絲狀真菌,因附生在樹木或木材上,引起木質(zhì)白色腐爛而得名。通過菌絲侵入木質(zhì)細(xì)胞腔內(nèi)并分泌、釋放降解木質(zhì)素和其他木質(zhì)組分的生物酶,導(dǎo)致木質(zhì)腐爛成為淡色的海綿狀團(tuán)塊白腐。分類學(xué)上,白腐真菌屬于真菌門,絕大多數(shù)為擔(dān)子菌綱,少數(shù)為子囊菌綱[1]。白腐菌有顯著的降解木質(zhì)素的能力,在所有能降解木質(zhì)素的微生物中,白腐菌是目前研究最系統(tǒng)的、對木質(zhì)素具有最強(qiáng)降解能力的一類真菌,它通過分泌胞外氧化酶來降解木質(zhì)素,這種木質(zhì)素降解酶系的主要成分有漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶等。近年來,有關(guān)漆酶的研究在國際上越來越受到重視。由于它在降解木質(zhì)素、微生物菌體形態(tài)形成以及植物病原等方面的功能,使其在制漿造紙工業(yè)、染發(fā)、飲料加工等方面得到了廣泛的研究和應(yīng)用。尤其在制漿造紙工業(yè)的紙漿生物漂白、廢水處理等方面具有很大的研究價值和應(yīng)用潛力。由于漆酶可與有毒的酚類物質(zhì)作用,使苯氧基類除草劑、石油工業(yè)廢物等造成環(huán)境污染的物質(zhì)去毒,因而頗具環(huán)保意義[2]。本文主要進(jìn)行產(chǎn)漆酶白腐菌的篩選,結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法對篩選得到的白腐菌進(jìn)行分類鑒定,為對該菌的進(jìn)一步研究提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 遼寧省朝陽市腐朽立木、伐木樁;錦州地區(qū)楊樹、槐樹上生長的子實體,菌蓋無柄,半圓形,墊狀,新鮮時軟木栓質(zhì),干后較硬,白色至淡黃色,有細(xì)毛。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①PDA綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,KH2PO40.3 g,MgSO4·7 H2O 0.15 g,瓊脂18 g,水1 L,pH自然,用于菌種初篩;②白腐菌變色反應(yīng)培養(yǎng)基(按徐曉峰等[3]介紹的方法略加改動)：KH2PO41.0 g,NaH2PO40.2 g,MgSO4·7 H2O 0.5 g,VB10.1 mg,CaCl20.1mg,FeSO4·7 H2O 0.1 mg,ZnSO4·7 H2O 0.01 mg,CuSO4·5 H2O 0.2 mg,愈創(chuàng)木酚100 mg,NH4NO38.06 mg,瓊脂18 g,水1 L,pH 5.0,用于菌種復(fù)篩;③PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂18 g,水1 L,pH自然,用于菌種保藏。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離和初篩[3]從采集的樣品中切下帶菌的部位,通常切成較小的塊,將采集的樣品用無菌水反復(fù)漂洗2次,每次約1 min,然后用無菌濾紙將樣品吸干,點接到PDA平板上,每個平板2～3塊,28℃培養(yǎng)2～3 d,挑選出長有白色菌絲或白色茸狀的菌落平板,將其反復(fù)純化直至獲得純菌株。將初步獲得的純菌株接種在PDA平板上,約培養(yǎng)4 d,用0.1 mol/L愈創(chuàng)木酚的乙醇溶液(0.5 g愈瘡木酚溶于30 mL 95%的乙醇中)滴定菌落邊緣,當(dāng)有漆酶存在時,滴定區(qū)域變成淺紅色。發(fā)生變色的菌株需進(jìn)行復(fù)篩試驗。

1.2.2 菌種的復(fù)篩 采用2種培養(yǎng)基對其進(jìn)行復(fù)篩,將初篩獲得的純菌株接種到變色反應(yīng)培養(yǎng)基平板中,每一菌株做2個平行,28℃培養(yǎng)9 d,觀察分析生長在培養(yǎng)皿中變色圈和菌絲圈尺寸的大小和菌絲顏色變化。

1.2.3 菌株的鑒定 ①菌株形態(tài)觀察：將菌株純培養(yǎng)物接種于PDA培養(yǎng)基,28℃下導(dǎo)致培養(yǎng),待剛長出菌絲時,將無菌的蓋玻片斜插入平板內(nèi)(插片法)[4],觀察并記錄菌落特征和菌體形態(tài)特征;②菌絲培養(yǎng)及基因組DNA的提取：將低溫保藏的白腐菌菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上,28℃培養(yǎng)。7 d后轉(zhuǎn)接到100 mL PDA液體培養(yǎng)基中,28℃100 r/min振蕩培養(yǎng)4 d,收集菌絲,FEN緩沖液洗滌后放入-20℃冰箱保藏備用。基因組DNA的提取在CTAB法[5]上略加改動,DNA提取物于-4℃冰箱貯藏備用;③ITS基因PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增采用真菌通用引物對ITS1/ITS4(由大連寶生物合成)。具體序列為ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應(yīng)體系(25μL)：10×buffer 2.5 μL,dNTP(各2.5 mmol/L)1μL,引物各1μL,Taq酶(83.35 nkat/L)0.25μL,模板DNA 1μL,ddH2O 18.25μL。PCR反應(yīng)條件：95℃變性5 min;95℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30個循環(huán),72℃延伸10 min。取5μL PCR產(chǎn)物,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用DNA凝膠純化試劑盒回收PCR產(chǎn)物;④PCR產(chǎn)物測序及系統(tǒng)發(fā)育分析：純化的產(chǎn)物由大連寶生物公司進(jìn)行正反鏈雙向測序。將測得的序列與在Gen-Bank中進(jìn)行BLAST搜索到的相關(guān)序列用CLUSTAL X[6]軟件進(jìn)行對位排列后再進(jìn)行手工校正。系統(tǒng)發(fā)育樹分析采用軟件MEGA4.1中的鄰近相鄰法進(jìn)行,利用bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離篩選

2.1.1 初篩 通過初步分離獲得25株具有漆酶活性的白腐菌,活性的大小還需進(jìn)行復(fù)篩。

2.1.2 復(fù)篩 漆酶活性的檢測可根據(jù)Bavendamm的方法進(jìn)行,由于培養(yǎng)基中加入一定量的愈創(chuàng)木酚,含有漆酶的菌株在這特定培養(yǎng)基上長出的菌絲能產(chǎn)生明顯的桔紅色。用Bavendamm方法能判斷菌株有無漆酶,而且根據(jù)變色圈顏色深淺能大致分析出試驗菌株含有漆酶活力高低。PualAnder等[7]報道,可以用變色圈和菌絲圈的比值作為判斷菌種選擇性降解木質(zhì)素的依據(jù)。對培養(yǎng)過程中每天變色圈和菌絲圈尺寸大小和變色圈顏色深淺變化進(jìn)行分析,篩選出1株產(chǎn)漆酶較高的菌株,編號為4220。此菌株作為進(jìn)一步研究的試驗菌株。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)觀察 菌絲生長快,平板在1周內(nèi)覆蓋。菌落白色,大而疏松,與培養(yǎng)基結(jié)合較緊密,接種點周圍菌絲較薄,可見平板反面,有較濃的蘑菇味,愈創(chuàng)木酚反應(yīng)20 min后滴定區(qū)域變?yōu)樯罴t褐色,見圖1;菌絲透明,節(jié)狀分隔,纖維菌絲較多,厚壁,菌絲大量分枝,有鎖狀聯(lián)合,見圖2。

2.2.2 菌株的ITS區(qū)PCR擴(kuò)增及測序 菌株4220的ITS區(qū)(含5.8S區(qū))PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示的條帶特異、效果好,見圖3。采用低熔點瓊脂糖法進(jìn)行切膠純化回收并測序。菌株4220 ITS區(qū)段總長度為636 bp。

圖3 ITS-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 ITS Amplification patterns

圖4 根據(jù)18S rRNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 18S rRNA sequences homology

2.2.3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的分析 GenBank中同源性較高菌株的ITS序列與本實驗所測的菌株ITS序列進(jìn)行比對,利用CLUSTAL X軟件將序列匹配排列后,利用MEGA4.1軟件采用鄰近相鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖4。EF488416(Schizophyllum comm une)為外類群(outgroup),樹枝上數(shù)值為bootstrap值。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出菌株4220與EU520145聚在同一分支,但置信度僅為20%,在上一級分支上的置信度為96%,結(jié)合菌體的形態(tài)學(xué)特征及子實體形態(tài)可以確定4220為Tram etes suaveolens。目前該菌已被Gen-Bank收錄,收錄號為GU199349。

3 討 論

本研究分離得到1株產(chǎn)漆酶活性較高菌株4220,經(jīng)形態(tài)學(xué)特性研究和ITS序列分析,鑒定該菌株為Tram etes suaveolens。傳統(tǒng)的真菌分類主要是根據(jù)子實體外觀形態(tài)或微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)特征,但表型特征受環(huán)境影響較大,這就使在不同環(huán)境條件下生長的同一種真菌經(jīng)常表現(xiàn)出較大的形態(tài)差異,給分類和鑒定帶來困難,真核生物編碼核糖體核酸的基因是一個串聯(lián)的重復(fù)轉(zhuǎn)錄單位,即18S rRNA-ITSI-5.8S rRNA-ITSII-28S rRNA,約100～200拷貝,包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)[8],編碼區(qū)18S、5.8S、28S rDNA基因序列進(jìn)化緩慢而相對保守,但這3個基因序列之間的ITS序列的進(jìn)化則相當(dāng)迅速,因而rDNA序列廣泛用于真菌各級水平的系統(tǒng)學(xué)研究。18S rDNA和28S rDNA分別約為1.8 kb和3.4 kb,序列中既有保守區(qū)又有可變區(qū),在進(jìn)化速率上比較保守,其中18S比28S基因更保守,是在系統(tǒng)發(fā)育中種級以上階元的良好標(biāo)記。5.8S基因分子量小且高度保守,較少用于系統(tǒng)學(xué)研究,但它為真菌r DNA PCR擴(kuò)增的通用引物的設(shè)計提供了極大方便。由于ITS區(qū)不加入成熟核糖體,所以受到的選擇壓力較小,進(jìn)化速率較快,在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性。同時ITS序列長度適中,從人類到酵母的各種真核生物中ITS的序列長度為1 000 bp到小于300 bp大小不等,人們可以從不太長的序列中獲得足夠的信息,可廣泛用于屬內(nèi)種間或種內(nèi)群體的系統(tǒng)學(xué)研究。所以rDNA ITS序列具有菌種分類鑒定的意義。

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