利用響應面分析方法優化生防細菌B579增殖培養基

楊秀榮,王雪蓮,王 敏,孫淑琴,劉水芳

(1.天津市植物保護研究所,天津 300112;2.天津科技大學生物工程學院,天津 300457)

從天津近郊蔬菜種植區分離篩選獲得1株生防細菌B579,經初步鑒定為芽胞桿菌屬(B acillus spp.),試驗表明該菌在室內平皿抑菌試驗和溫室盆栽試驗中均對土傳病害表現出明顯的防治效果[1],本研究旨在利用Plackett-Bur man和響應面等實驗設計確定及優化該菌增殖的培養基[2],使單位體積活菌數增加,為后續的放大培養提供依據。Plackett-Burman設計法是一種2水平的實驗設計方法,它可以利用最少的實驗次數,從眾多的考察因素中快速有效地篩選出主要的影響因子,因而被廣泛應用于因子主效應的估計中[3]。響應面法(Response Surface Methodology,RS M)是一種優化生物過程的綜合技術,采用該法可以建立連續變量曲面模型[3-4],對影響生物產量的因子水平及其交互作用進行優化與評價[4-5]。因此,它可快速有效地確定生物過程的最佳條件,該法已被廣泛用于培養基優化實踐中[5-6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 生防細菌B579從天津近郊蔬菜種植田分離獲得,現保存于天津市植物保護研究所生防室。

1.1.2 培養基(g/L) ①PDA培養基：馬鈴薯

200,葡萄糖(或蔗糖)20,瓊脂18,pH自然;②肉汁胨培養基：牛肉浸膏3,蛋白胨10,NaCl 5,pH 7.2;③LB培養基：蛋白胨10,酵母提取物5;NaCl 10;pH 7.2;④Plackett-Burman實驗發酵培養基：按照實驗設計配制;⑤RS M實驗發酵培養基：同上。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發酵實驗 將斜面培養1周的生防細菌B579接種到裝液量為30 mL的250 mL三角瓶中,37℃、180 r/min搖床培養12 h,使菌體處于對數生長期。然后以一定的接種量接種到發酵培養基中,在搖床轉速為180 r/min和合適的溫度條件下恒溫培養24 h。

1.2.2 生防細菌B579菌體量的測定 將發酵液稀釋100倍后,在600 nm下用分光光度計測量其濁度。

1.2.3 Plackett-Bur man實驗設計 根據生防細菌B579生長所需營養的基本原則,結合相關文獻和前期的實驗,本實驗選取的影響因素共10個。因此,選用了N=12的PB設計表,各參數及其水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平及編碼Table 1 Level and code of variables for Plackett-Burman design

1.2.4 最陡爬坡實驗設計 根據擬合的一階模型回歸系數的符號和大小來設計顯著因素的最陡上升路徑,而其他因素的取值則根據Plackett-Burman實驗結果中各因素效應的正負和大小,正效應的因素均取較高值,負效應的因素取較低值[15]。

1.2.5 Box-Benhnken中心組合設計優化培養基根據最陡爬坡試驗結果,確定下一步試驗水平的中心點和各水平的步長。選取響應值為菌體量,自變量為顯著因子的水平,借助實驗設計軟件SAS,進行Box-Benhnken設計。

1.2.6 菌體數量的測定(活菌的計數法) 將發酵液在無菌條件下10倍稀釋至10-7、10-8、10-9,并將此3個稀釋度在無菌條件下,吸取1 mL于無菌平板中,每稀釋度重復3次。將滅菌后冷至不燙手的平板計數培養基倒入平板中(10～12 mL),迅速旋轉平板,混勻后使培養基鋪滿整個平板,凝固后倒置平板于30℃培養箱中,20 h后取出查菌落數。

2 結果與分析

2.1 影響生防細菌B579增殖的重要因素

Plackett-Bur man試驗結果見表2,各因素方差分析見表3。從表3的概率P值大小可看出,對生防細菌B579菌株發酵液中的菌體量具有顯著影響的因子是黃豆餅粉、玉米粉和牛肉膏,考慮這3個因素的效應(t值)大小,確定它們為下一步試驗的關鍵因素。由于其他因子對響應值影響均不顯著,因此,在進一步篩選時正效應的因素均取較高值,負效應的因素取較低值。

表2 N=12的Plaekett-Burman實驗設計與響應值表Table 2 Design and response of N=12 Plackett-Bur man test

2.2 最陡爬坡試驗

表4列出了顯著因素的變化方向、步長和試驗結果。由表4可知,菌體量在0到(0+1Δ)之間有一個明顯的上升,之后開始下降,培養基成分最佳含量在(0+1Δ)和(0+2Δ)之間,故以(0+1Δ)條件為后續試驗中心點。

表3 Plackett-Burman試驗各因素參數分析Table 3 The parameter estimates of variables of Placktt-Burman design

表4 最陡爬坡實驗設計及結果Table 4 Experimental designs and the results of steepest ascent

2.3 Box-Benhnken實驗數據的確定

依據Plackett-Bur man實驗結果及最陡爬坡試驗,選取黃豆餅粉、玉米粉、牛肉膏作為響應面設計的變量,各因子及其編碼見表5,進一步借助實驗設計軟件SAS,進行Box-Benhnken設計。

2.4 Box-Benhnken實驗設計

依據Box-Benhnken設計所得響應值結果見表6,回歸方程中回歸系數估計值見表7,最終擬合的二次回歸方程式為：Y1=0.222-0.000 625 X1-0.000 125X2-0.000 5X3-0.011 375X1X1-0.001 25X1X2-0.01X1X3-0.006 375X2X2-0.001 5X2X3-0.009 125X3X3,通過模型的可信度分析(見表8),R2=0.997 3,離回歸標準差為0.000 671,說明該回歸方程的擬合程度較好。

表5 Box-Benhnken設計各因子及其編碼值Table 5 Assigned concentration of each variable at different levels in Box-benhnken design

表6 Box-Benhnken試驗設計方案及響應值Table 6 Design and response of Box-Benhnken

表7 回歸方程中回歸系數的估計值Table 7 Coefficient estimated value in regression equationdesign

表8 模型可信度分析Table 8 Reliability analysis in model

2.5 數據分析圖

依以上回歸方程繪制分析圖,可得圖1、圖2、圖3,從各圖可以看出,X1、X2和X3存在極點值。運用SAS對回歸模型進行規范性分析,尋找最優相應區,分析可知,回歸模型存在穩定點(X1、X2、X3)為(30.2、31和23.5 g/L)。這說明X1(玉米粉)的最佳范圍為31 g/L,X2(牛肉膏)的最佳范圍為23.5 g/L,X3(黃豆餅粉)的最佳范圍為30.2 g/L。

圖1 Y=f(X1X2)響應面立體圖Fig.1 The stereogram of Y=f(X1X2)response surface analysis

圖2 Y=f(X1X3)響應面立體圖Fig.2 The stereogram of Y=f(X1X3)response surface analysis

2.6 驗證試驗

由以上試驗得到最優配方：黃豆餅粉、玉米粉、牛肉膏分別在30.2、31和23.5 g/L的條件下,可使生防細菌B579獲得最大菌體量,驗證試驗證實了該方程的預測值與實際值之間吻合較好。優化后的培養基使菌體量從起始LB培養基的7.3×109cfu/mL提高到8×1011cfu/mL,見表9。

圖3 Y=f(X2X3)響應面立體圖Fig.3 The stereogram of Y=f(X2X3)response surface analysis

表9 最優培養條件下生防細菌B579菌量值Table 9 The number of bacteria in good condition

3 討 論

傳統的數理統計方法(線性回歸分析和正交試驗設計)在工農業生產和科學研究中有著廣泛的應用。但存在一些缺點：線性回歸分析雖然可以利用實驗數據得出因素與指標(即響應值)之間的回歸方程,但要求數據量大,費時耗資,且只是討論一種因素的影響,無法綜合考慮幾種因素的綜合作用。正交試驗設計則注重如何科學合理地安排試驗,可同時考慮幾種因素,尋找最佳因素水平組合;但它不能在給出的整個區域上找到因素和響應值之間的一個明確的函數表達式,即回歸方程。從而無法找到整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值。因此期望找到一種試驗次數少、周期短,求得的回歸方程精度高、能研究幾種因素間交互作用的回歸分析方法,響應面分析方法在很大程度上滿足了這些要求,該方法既經濟省力,優化效率又高,且處理數據由計算機完成。數據中隱含的規律用立體圖直觀表示出來,并用數學模型描述,從而揭示深層次的規律。本文利用該方法獲得以黃豆餅粉、玉米粉、牛肉膏為主要影響因子的培養基及最佳配比,為生防細菌B579的進一步研究與開發應用奠定了基礎。

RSA有許多方面的優點,但它仍有一定的局限性。首先,如果你將因素水平選的太寬,或選得關鍵因素不全,將會導致響應面出現吊兜或鞍點,因此試驗前進行充分的調研和預備性試驗是非常必要的。而且通過回歸分析得到的結果只能對該類試驗作估計。此外,當回歸數據用于預測時,只能在因素所限的范圍內進行預測。

[1] 楊秀榮,王雪蓮,王敏,等.生防細菌B579對土傳病害的防治效果及促長作用[J].中國生物防治,2008,24(增刊)：59-61.

[2] 徐子鈞,李劍,梁鳳來,等.利用SAS軟件優化L-乳酸發酵培養基[J].微生物學通報,2004,31(3)：85-87.

[3] Kalil S J,Maugeri F,Rodrigues M I.Response surface analysis and simulation as a tool for bioprocess design and optimization[J].Process Biochemistry,2000,35：539-550.

[4] 王允祥,呂鳳霞,陸兆新.杯傘發酵培養基的響應曲面法優化研究[J].南京農業大學學報,2004,27(3)：89-94.

[5] 劉建忠,熊亞紅,翁麗萍,等.生物過程的優化[J].中山大學學報,2002,41(增刊)：132-137.

[6] Ramkrishna S,Swaminmhan T.Response surface modeling and optimization to elucidate and analyze the efects of inoculums age and size on surfactin production[J].Biochemical Engineering Journal,2004,21：141-148.