嗜麥芽寡養單胞菌D2株單加氧酶基因的克隆與表達

辛曉妮,閆志勇,楊 麗,吳 瑤,王 斌,宋旭霞,羅 瑋

(青島大學醫學院,山東青島 266070)

嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophom onas m alto-phila)屬黃單胞菌科寡養單胞菌屬,是一種需氧革蘭陰性桿菌,廣泛分布于水、土壤、植物根系、人和動物的體表與消化道中,具有很強的代謝活性及廣泛的適應能力。近年來研究發現,該菌能產生多種具有較高研究開發價值的生物活性物質,如蛋白酶、氧化酶、堿性磷酸酶、酪氨酸酶、纖溶酶、脂肪酶、淀粉酶等[1-2]。本實驗室從海洋生物雙齒圍沙蠶消化道中分離出1株嗜麥芽寡氧單胞菌(D2株),前期研究結果顯示其具有顯著的蛋白酶活性和纖維蛋白溶解活性[3]。在分析構建D2株基因組文庫時發現,該菌株具有編碼單加氧酶(monooxgenase,MO)的基因片段。單加氧酶是一種在有機氧化反應中起關鍵作用的生物催化劑,能有效地、特異地向有機底物中插入1個氧原子,具有反應條件溫和、速度快、專一性強等特點,在環保、工業等領域中具有重要作用[4]。本研究通過基因重組技術獲得了D2菌株單加氧酶的完整的編碼基因序列,構建了融合表達載體,并成功進行了原核表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 嗜麥芽寡養單胞菌D2株由本室閆志勇副教授分離自海洋生物雙齒圍沙蠶消化道,已被中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CG MCC)收藏,收藏號CG MCC 1868;pMD18-T購自大連寶生物工程有限公司;pET32a(+)、大腸埃希菌JM109、BL21(DE3)為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 ①試劑：細菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、Taq酶購自Promega公司;DNA Marker、dNTPs購自TAKARA公司,質粒小提試劑盒購自Omega公司;X-gal、氨芐青霉素、IPTG購自Sigma公司;②儀器：基因擴增儀購自德國Eppendorf公司;UVP GDS8000型凝膠成像系統購自美國UVP公司。

1.2 方法

1.2.1 D2菌株基因組DNA的提取 將D2接種于LB培養基,48 h后挑取單個菌落,接種于LB液體培養基,12 h至菌液OD600值約為0.6,參照Promega細菌基因組DNA抽提試劑盒的說明書提取基因組DNA。

1.2.2 D2株基因組文庫的構建及部分克隆的分析 用Sau3A I酶切D2株基因組DNA,回收0.2～2 kb的DNA片段,連接至pUC18質粒載體,轉化大腸埃希菌JM109,在含有Amp的LB平板上篩選重組子,酶切鑒定后建庫保存;隨機挑取陽性克隆測序,在網絡數據庫中進行BLAST分析。

1.2.3 PCR擴增單加氧酶全基因序列 經對D2株基因組文庫中部分克隆的分析發現,有一克隆序列與GenBank中嗜麥芽寡養單胞菌R551-3和K279a單加氧酶基因具有較高的同源性,為單加氧酶基因的部分基因片段。為獲得該菌的全基因序列,將上述2株細菌的單加氧酶基因用DNA Star軟件進行分析,根據保守區序列使用設計引物：For ward：5′-GATCGGCGAGCAGGACCAGT-3′,Reverse：5′-AGTTCTACATCGACATCGCGCGT-3′,擴增產物長度約1 300 bp,由上海Invitrogen公司合成。在100μL體系中分別加入模板DNA 1.0μL,dNTPs 10μL,MgCl24.0μL,上下游引物各4.0μL,TaqDNA聚合酶1.5μL;PCR的循環條件為94℃變性5 min,然后94℃1 min、56℃1 min、72℃1 min,30個循環后72℃延伸10 min。PCR結束后取將產物1.2%的瓊脂糖凝膠電泳,用UVP GDS8000型凝膠成相系統分析結果。

1.2.4 單加氧酶基因的克隆和序列測定 使用Promega公司W izard PCR preps DNA purificaton system試劑盒純化PCR產物。純化后的產物按常規方法與pMD18-T于4℃過夜后連接,TSS法制備大腸埃希菌JM109感受態并轉化,藍白斑篩選陽性克隆,Omega公司質粒提取試劑盒提取重組質粒,EcoR I酶切鑒定。將經過酶切鑒定的含陽性克隆的菌液送上海Invitrogen公司用AB I3730自動測序儀測序。

1.2.5 D2株單加氧酶基因的體外原核表達克隆的構建和表達 ①引物的設計與PCR擴增：根據1.2.3獲得的基因序列,找出單加氧酶基因的ORF,并設計表達擴增引物,Forward：5′-CG ggatcc ATGAGCTATCAGATCAGCGTC-3′,Reverse：5′-TAT aagctttCAGGCCACCGCCGCG-3′,下劃線部分分別為BamHⅠ和HindⅢ的酶切識別位點,產物長度996 bp。以重質粒為模板進行PCR擴增;②表達克隆的構建和鑒定：使用Promega公司的試劑盒純化PCR產物,將該回收產物及pET-32a(+)分別用B amHⅠ和HindⅢ進行雙酶切,凝膠電泳后用Omega公司Cycle-Pure kit試劑盒純化回收酶切產物。將回收的目的基因片段和表達載體pET32a(+)片段用T4連接酶于16℃過夜鏈接,然后TSS法轉化大腸埃希菌BL21,在ALB平板上挑選重組克隆,提取質粒后用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定;③目的基因的表達：挑取酶切鑒定正確的重組子,用ALB液體培養基37℃過夜培養至OD600值為0.8時,1：100接種入新的ALB液體培養基,37℃培養至OD600值約為0.8后,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,37℃誘導5 h,取菌液沉淀SDSPAGE電泳觀察表達蛋白。

2 結 果

2.1 嗜麥芽寡養單胞菌D2株單加氧酶基因的序列測定

以嗜麥芽寡養單胞菌D2株的基因組DNA為模版進行PCR擴增,獲得了包含嗜麥芽寡養單胞菌D2株單加氧酶編碼基因在內的約1 300 bp的產物,見圖1,將其連接到pMD18,挑選重組載體EcoRⅠ酶切鑒定,見圖2,經鑒定證實后的重組基因測序,獲得了長度為1 327 bp的基因序列信息(GenBank收錄號GQ122330)。

圖1 包含編碼基因在內的PCR擴增產物Fig.1 the amplified product by polymerase chain reaction including coding gene

2.2 嗜麥芽寡養單胞菌D2株單加氧酶基因表達克隆的構建與鑒定

對2.1的測序結果進行分析,發現其中包含了1個長度996 bp的完整ORF,根據其序列設計引物,以重組pMD18為模版進行PCR擴增,獲得了嗜麥芽寡養單胞菌D2株單加氧酶編碼基因完整的編碼基因,見圖3。將該基因片段連接到表達載體pET32a(+)中,重組克隆pET32a/MO經B amHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定證實,見圖4。

經PubMed中分析發現,D2株單加氧酶與GenBanK中收錄的S.m altophiliaR551-3(GI 194346582)及S.m altophiliaK279a(GI1900100-13)相比,ORF基因序列的同源性分別為90%和89%,而氨基酸序列同源性高達96%和95%;且該氨基酸中含有flavin-utilizing monooxygenase超家族的共同保守區。

2.3 嗜麥芽寡養單胞菌D2株單加氧酶基因的體外原核表達

重組pET32a/MO轉化宿主菌BL21后,經過IPTG誘導,表達出大小約54 ku的融合目的蛋白,與設計相符,見圖5。

圖5 重組pET32a/MO在宿主菌BL21中的表達Fig.5 Expression of the recombined vector pET32a/MO inE.coliBL21

3 討 論

嗜麥芽寡養單胞菌廣泛分布于人體內和外界環境中,因其既能導致人或動植物疾病,又可分泌多種生物活性物質,因而近年來引起廣泛關注。2008年分離自醫院感染的腫瘤病人血液的該菌K279株[5]和植物毛果楊(Populus trichocarpa)中的R551株[6]的全基因序列測序先后完成;對上述2株細菌的全基因組序列進行了系統的比較,發現該菌具有許多基因組島(genomic islands,GEIs),其編碼蛋白與嗜麥芽寡養單胞菌的天然耐藥、生物活性物質的合成和分泌有關[7]。

海洋中蘊含豐富的微生物資源,其中包含了非常有研究價值的海洋微生物基因信息,“海洋生物基因組計劃”項目成為世界各海洋大國的焦點,目的在于通過獲得相應的遺傳序列,全面尋找有價值的遺傳信息,更有效地開發和應用海洋微生物等資源。嗜麥芽寡養單胞菌D2株是本實驗室自2003年從生活于海岸潮間帶的海洋生物雙齒圍沙蠶消化道內分離出的一種海洋微生物,能分泌產生許多胞外的生物活性物質[8];在對構建的D2株基因組文庫分析時,發現一克隆的基因序列與K279株和R551株熒光素樣單加氧酶基因序列有較高的同源性。

單加氧酶是將單個氧原子加入到一個有機化合物分子中的一類酶,能使非反應烴轉化為可利用烴,把烷烴轉化為醇或脂肪酸,把烯烴轉化為環氧化物,使芳香烴開環[5],高度特異性催化作用是其最顯著特征。單加氧酶具有降解體內潛在的毒性化合物,合成次級代謝物、激素、信號分子等生理作用;此外,因其具有選擇性生物氧化的特性,某些單加氧酶能參與藥物之間的相互作用而被用于新藥的開發和研制,而有的則能應用于降解工業環境中有害的有機物。由此可見,單加氧酶在環境保護、藥物研制等方面具有潛在應用價值。然而,對于熒光素樣單加氧酶的酶學特征和生物學功能目前尚未見報道。

本文根據GenBank收錄的單加氧酶全基因序列設計引物,從D2基因組DNA中擴增出包含該單加氧酶完整開放讀碼框(ORF)的核酸片段,并將該ORF亞克隆到pET32a中,最終成功地在體外原核系統中表達出了單加氧酶的融合蛋白,為將來進一步研究該熒光素樣單加氧酶的生物學功能、結構等奠定了基礎;同時,本文也再次證實D2菌株具有產生多種生物活性物質的能力,豐富了海洋微生物基因信息。

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