發酵法酶解菜籽粉中植物蛋白的初步研究

梁盛年

(肇慶學院 生命科學學院，廣東 肇慶 526061)

0 引言

植物蛋白具有許多生理功能.例如：對肝硬化患者具有營養支持作用；能降低膽固醇水平；能減少癌癥的發生；還能夠改善腎臟病和心血管疾病的癥狀等.隨著科技的進步，植物蛋白[1]的功能不斷被揭示并得到發展.我國植物蛋白資源豐富，每年以大豆、花生、油菜籽、棉籽等為原料的油料產品約達1.4億t，這些均為較好的植物蛋白資源.植物蛋白的開發利用有很多途徑，近幾年人們研究得最多的是棉籽[2]、菜籽[3]、大豆[4]等幾種植物的蛋白水解.植物蛋白的水解方法主要有酸法、堿法和酶法[5－6].堿法和酸法工藝中的最終產物需中和反應，因鹽的濃度太高，不利于使用.采用酶法進行水解，產品的顏色和味道優于堿法和酸法[2]38.本文中，筆者通過探討微生物發酵法酶解植物蛋白在不同溫度、不同物料比和不同水解時間條件下發酵液的水解度，即蛋白質的消化率，尋求較好的水解條件，為微生物發酵法酶解植物蛋白的生產工藝提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

S13菌株，能產堿性蛋白酶，由肇慶學院生命科學學院微生物實驗室提供.

1.1.2 菜籽粉

本實驗所用的菜籽餅在飼料市場中購得，油菜籽榨油后的餅塊粉碎成粉狀作為菜籽粉，約含20%～30%的蛋白質.

1.1.3 培養基[7]

1）牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 g，NaC l0.5 g，100 mL蒸餾水，pH值為9.5.

2）發酵培養基：體積分數為1.5%的葡萄糖，體積分數為1.0%的酵母浸膏，Na2HPO40.4 g，NaCO30.3 g，KH2PO40.03 g，蒸餾水100 mL,pH值為9.5.

1.1.4 化學試劑

1）硫酸銅，硫酸鉀，硫酸，硼酸溶液（20 g/L）和氫氧化鈉溶液（400 g/L）.

2）0.010 5 mol/L鹽酸標準溶液，0.047 3 mol/L NaOH標準溶液，體積分數為36%的甲醛溶液.

3）體積分數為0.1%的甲基紅乙醇溶液1份，體積分數為0.1%的溴甲酚綠乙醇溶液5份，臨用時將它們混合在一起.

1.1.5 實驗儀器

實驗所用儀器如下：標準型雙人凈化工作臺；自動回流消化儀；微量凱氏定氮裝置；干燥箱（101－1型）；微型植物粉碎機（FZ102型）；電子天平（JA5003N）；磁力加熱攪拌器（79－1）；pH計（PHS－3C型）；恒溫培養振蕩器（SKY－200B型）；隔熱式電熱恒溫培養箱（PYX－DHS）.

1.2 方法

1.2.1 凱氏定氮法測定菜籽粉中的蛋白質含量

按文獻[8]中的方法將樣品進行消化、蒸餾、滴定，并計算出菜籽粉中的蛋白質含量.

1.2.2 S13菌株活化及擴大培養

將斜面保藏的S13菌株接種到牛肉膏蛋白胨斜面培養基上，在37℃的溫度下活化培養24 h后再擴接到裝有發酵培養基的三角燒瓶中，調好pH值，并用恒溫培養振蕩器在37℃的溫度下振蕩培養24 h，菌液待用.

1.2.3 酶解條件及方法

取5個500 mL的三角燒瓶，分別加入5 g菜籽粉，再按1:10，1:20和1:30的比例分別加入50 mL，100 mL，150 mL的菌液搖勻；置于恒溫培養振蕩器上，在32℃的溫度及180 r/min的條件下恒溫振蕩水解6 h（振蕩水解過程維持pH值不變），取出，加熱作酶鈍化；將水解液過濾，作為測定蛋白質消化率的待測液.

按上述操作方法，再分別作35，37，40，42℃4種溫度及180 r/min條件下12，24，32 h的恒溫振蕩水解，水解液作相同處理.以不加菌液作相同條件處理的水解液作為空白對照.

1.2.4 電位滴定法測定氨態氮[9]

1）吸取待測液5.0 mL加水定容至100 mL作為試樣液.2）吸取20 mL置于100 mL燒杯中，再加入70 mL蒸餾水.3）燒杯放到磁力攪拌器上，插入酸度計，開啟攪拌器，用氫氧化鈉溶液進行滴定，使溶液pH值達到8.2，記錄消耗氫氧化鈉溶液的體積.4）加入10.0 mL甲醛溶液，混勻，用氫氧化鈉溶液進行滴定，使溶液的pH值為9.2，記錄消耗氫氧化鈉溶液的體積V3.5)量取空白對照液作同樣測定,得消耗氫氧化鈉溶液的體積V4.計算公式如下：

其中，X3：樣品中氨基酸態氮的質量濃度，g/L；V3：測定樣品在加入甲醛后滴定至終點（pH值為9.2）所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V4：空白對照液加入甲醛后滴定至終點（pH值為9.2）所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；N：氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L；0.014：與1 mL氫氧化鈉標準溶液相當的氮的質量，g.

1.2.5 蛋白質消化率的計算方法

蛋白質的消化率＝X3與菜籽粉總氮之比，可以用如下公式計算：

其中，X3：樣品中氨基酸態氮的質量濃度，g/L.

2 結果與分析

2.1 菜籽粉中蛋白質的質量分數測定

用凱氏定氮法測得菜籽粉中蛋白質的質量分數為25.52%.

2.2 不同酶解條件下菜籽粉中蛋白質的消化率

按實驗預設的方法分別做了物料比為1:10，1:20，1:30，溫度為32，35，37，40和42℃，水解時間為6，12， 24和32h的水解實驗，實驗結果見表1、表2和表3.

表1 不同溫度條件下，物料比為1:10時處理氨態氮的消化率比較

表2 不同溫度條件下，物料比為1:20時處理氨態氮的消化率比較

表3 不同溫度條件下，物料比為1:30時處理氨態氮的消化率比較

從表1～3的結果可以看出，用S13菌株培養液酶解菜籽粉中的植物蛋白呈現一定的規律性:即消化率隨物料比的提高而增大；它也隨溫度的升高而增大，到37℃時達到峰值，然后隨溫度升高反而下降；消化率隨水解時間延長而不斷增大，但24h后趨勢變得很緩慢，水解率增加不大.據此，可初步確定37℃和24h為較適宜的水解條件.為進一步弄清物料比對消化率的影響，筆者補做了在37℃和24h的水解條件下，物料比為1:40和1:50時的水解實驗，結果見表4.

表4 不同物料比處理氨態氮的消化率比較

從表4結果可見,當物料比進一步增大時,消化率反而下降,由此可認為物料比為1:30是較適宜的水解條件.至于水解時間對消化率的影響，從能耗方面考慮，筆者認為選24h比較適宜.

S13菌株為一桿狀細菌，37℃為其最適宜的生長溫度，培養24h達到生長對數期.將S13菌株用發酵培養基培養24h，在酶活力最高時將其與菜籽粉混合，讓發酵液中的堿性蛋白酶直接作用于菜籽粉中的植物蛋白，將其酶解為多肽，能取得較佳的水解效果.

3 結論與討論

用S13菌株培養液酶解菜籽粉中的植物蛋白，較好的反應條件為：溫度為37℃，物料比為1:30，經24h恒溫搖床振蕩水解，所得蛋白質的消化率可達16.61%.

本實驗得到的蛋白質的消化率約為16%，與文獻[6]所報道的酶解結果比較，消化率偏低.其原因是文獻[6]中使用的是純酶，酶活性較高；而本實驗是直接用產酶菌株培養24h后所產的蛋白質酶做酶解實驗，所產的酶未經提純，酶活性較低，因而所得蛋白質的消化率也較低.但與文獻[3]中的酶解結果比較，本實驗所得蛋白質的消化率高2%.這表明，直接應用能產蛋白酶的微生物進行植物蛋白水解的方法應有可取之處.本實驗采取的方法具有操作簡單、成本低、水解快速及重現性好等優點，它為進一步探索微生物發酵法酶解菜籽粉中植物蛋白的生產工藝提供了依據.

[1] 陳貴堂,趙霖.植物蛋白的營養生理功能及開發利用[J].食品工業科技,2004(9):137-139.

[2] 郭城,鄭競成.酶法水解棉籽蛋白的研究[J].中國油脂,2007,32(8):38-40.

[3] 周鴻翔,邱樹毅,楊洪丹,等.風味蛋白酶水解菜籽蛋白條件研究[J].食品工程,2009(2):32-34.

[4] 盧楠,雷瑩,郭立達.酶法水解大豆分離蛋白的研究[J].河北師范大學學報：自然科學版,2009,33(4):499-514.

[5] 范恒君.酶法水解植物蛋白[J].南寧職業技術學院學報,2000,3(5):57-61.

[6] 李樹品,李梅,蔣千里.植物蛋白的酶法水解[J].山東科學,1997,1(3):53-56.

[7] 沈萍,范秀容,李廣斌.微生物學實驗[M].北京:高等教育出版社,1999:50-51.

[8] 張水華.食品分析實驗[M].北京:化學工業出版社,2006:45-47.

[9] 王叔淳.食品衛生檢驗技術手冊[M].2版.北京:化學工業出版社,1994：101-107.