西瓜果實中L-瓜氨酸的提取與測定

摘 要：為采用單因素試驗和正交設計對西瓜果實中L－瓜氨酸的提取與簡易測定方法進行篩選。結果表明，以無水甲醇－6mol·L_-1HCl(V/V=9：1)為提取劑，瓜瓤或瓜皮與提取劑的比例為1：1.5、提取溫度55℃、提取時間20min提取效率最高。用活性炭脫去瓜瓤底色，每10g榨汁液活性炭用量為10g。根據L-瓜氨酸在強酸溶液中與二乙酰一肟的專一顯色反應及反應復合物在490nm處吸光度與L-瓜氨酸濃度呈線形關系的特點，建立了L-瓜氨酸的分光光度測定方法，實驗證明該方法準確、簡便、靈敏。

關鍵詞：西瓜；L-瓜氨酸；提?。簻y定

中圖分類號：S651 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)04-650-05

瓜氨酸是首先從西瓜汁中發現的人體內非蛋白質氨基酸。其存在形式主要是L－瓜氨酸。L－瓜氨酸能夠使人體產生出氮氧化物，而氮氧化物能夠提高男性的性能力。此外，L－瓜氨酸還能全面增強男性的身體狀況，促進血液循環，保護心血管。L－瓜氨酸還可以作為抗衰老、提高免疫力的保健品和女性護膚去斑的美容品。我國西瓜面積維持在100萬hm²以上，西瓜是夏季的主要水果，其果實內含有豐富的L一瓜氨酸，并且鮮食即可被人體直接吸收而產生保健功能。Agnes等對14個西瓜品種果實中的L-瓜氨酸含量進行了測定，瓜氨酸的含量范圍為0.6～3.6mg·g^-1。其測定品種中三倍體西瓜L-瓜氨酸平均含量稍高于二倍體，黃瓤品種稍高于紅瓤品種。關于瓜氨酸的研究主要側重于生理功能方面，而有關西瓜果實中L-瓜氨酸的提取和測定報道甚少，開展西瓜中L-瓜氨酸物質含量的測定研究，對于了解西瓜功能性成分及開展功能性西瓜育種有重要意義。

Agnes等用GC-MS(即氣相色譜-質譜聯用)測定了西瓜瓜瓤及瓜皮中L-瓜氨酸的含量，其方法準確，但存在測定步驟繁瑣，測定成本高等缺點，不適合測定大批量樣品。目前尚缺乏一種準確、簡易的L-瓜氨酸提取工藝及測定方法。我們旨在研究不同的提取液、提取溫度、提取時間等對提取結果的影響及簡易的西瓜瓜氨酸測定方法建立。為西瓜功能性成分研究、西瓜育種、生產、加工提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗于2006年12月－2007年3月進行，選用開雜2號西瓜作為實驗品種，并隨機測定了黑美人、鄭抗無籽3號、開雜2號、特小風4個市售西瓜品種果實的L-瓜氨酸含量。

1.2 方法

西瓜中L-瓜氨酸提取測定的一般流程：西瓜→縱切→去子→去表皮→稱取100g瓜瓤或瓜皮打漿→取10g加提取劑→55℃水浴→過濾脫色→釋→100℃水浴→測定計算L-瓜氨酸的含量。西瓜果實中的L-瓜氨酸含量的計算方法：L-瓜氨酸的含量(mg·g^-1)=(kX+b)x20，式中X為490nm處的吸光度的值，k為標準曲線的斜率，b為標準曲線的截距，20：總稀釋倍數。

1.2.1 提取液的確定 初步選定了A：甲醇－6mol·L^-1HCI(V/V=9：1，pH0)，B：乙醇-6tool·L^-1HCl(V/V=9：1，pH0)，C：甲醇-6 mol·L^-1HCl(V/V=18：1，pH0，16)，D：乙醇-6mol·L^-1HCl(V/V=18：1，pH0.16)，E：55℃熱蒸餾水(pH6.98)5種方法提取西瓜中的L-瓜氨酸。

1.2.2 提取液用量的確定 瓜瓤或瓜皮與提取液A之間的比例(W：V，g·mL^-1)分別為1：0.5、1：1、1：1.5、1：2.0。取10g瓜漿，加入不同體積的提取液。

1.2.3 提取時間的確定 設置水浴提取時間：10、15、20、25、30min。

1.2.4 提取溫度的確定 設置提取溫度：45、50、55、60、65℃。

1.2.5 活性炭用量的確定 因瓜瓤有色，故用活性炭吸附顏色，以消除本底顏色對測定結果的影響。在上述提取條件下，設置活性炭量：5、7、10、13、15g。

1.3 數據統計分析

采用DPS3.01進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 L-瓜氨酸提取條件的單因素試驗結果

2.1.1 提取液的確定 由圖1可以看出，提取液A(甲醇－6mol·L^-1HCl V/V9：1，pH 0)的提取效率最高，其次是提取液B(乙醇-6mol·L^-1HCl^-1=9：1，pH0)、C(甲醇-6mol·L-1H^-1HCl V/V=18：1，pH 0.16)、D(乙醇-6mol·L^-1 HCl V/V=18：1，pH 0.6)、55℃熱蒸餾水。相同條件下甲醇>乙醇，考慮到甲醇的提取效率稍高，本實驗選擇A(甲醇-6 mol·L^-1HCl V/V=9：1，pH0)作提取液。

2.1.2 提取液量的確定 由圖2可知，以A(甲醇－6mol·L^-1HCl V/V=9：1，pH0)作為提取液，瓜瓤或瓜皮與提取液比例為1：0.5時，L-瓜氨酸提取率較低，當比例為1：1.5時，提取率達到最大，但隨著提取液用量的增加，提取率不再增加，說明瓜瓤或瓜皮與提取液比例為1：1.5時L-瓜氨酸已被充分提取。從節約成本。提高利用率考慮，瓜瓤或瓜皮與提取液比例宜為1：1.5。在55℃水浴提取過程中，應在恒溫搖床里搖動3次，以保證物料與提取液充分混勻及L-瓜氨酸的充分提取。

2.1.3 提取時間的確定 由圖3可知，L-瓜氨酸提取量隨時間的延長而增大，在提取時間為20min時，L-瓜氨酸提取率已達最大，但隨著浸提時間的延長，L-瓜氨酸提取量不但不會增加，反而減少，說明提取時間以20min為宜。

2.1.4提取溫度的確定 由圖4可知，提取溫度對L-瓜氨酸提取的效率影響較大。45℃～55℃內，L-瓜氨酸提取量隨溫度的升高而增大，溫度55℃時提取效果最好，60℃時提取效率明顯下降。

2.1.5 活性炭量的確定 活性炭對L-瓜氨酸的吸附作用。實驗設計25mL的0.05g·L^-1 L-瓜氨酸分別加入5、7、10、13、15g活性炭。充分搖勻過濾后，測定回收率。結果表明，活性炭對L-瓜氨酸無吸附作用，加入活性炭量可根據需要而定。

瓜瓤本底顏色影響L-瓜氨酸測定的結果。由圖5可知，活性炭對瓜瓤本底顏色有一定的吸附作用，隨著活性炭量的加大，活性炭對瓜瓤本底顏色的吸附作用也在加大。當活性炭量從5g增加到10g時，吸附作用增加明顯，從10g增加到15g時，干擾測定結果的色素已被基本吸附完，故活性炭量選擇10g為宜。

2.2 L-瓜氨酸提取因素的正交優化

從以上單因素試驗可以看出，提取效率受到提取液、提取液用量、提取時間、提取溫度這4個因素影響較大，活性炭只起脫色作用，對提取效率無影響，為了全面考察這4個因素的作用大小和優化組合，設計了4因素3水平的正交試驗。由表1的正交試驗極差R值可以看出，各因素變化對L-瓜氨酸提取率的影響程度依次為A>C>B>D，即提取液是影響L-瓜氨酸提取效率的最主要因素，料液比、提取時間、提取溫度均為次要因素。從各因素極差分析結果看最優組合為A₁B₂C₂D₃，從實際測定值差異顯著性分析可知，最優組合為A₁B₂C₂D₃，說明因素之間有互作發生。本試驗采取提取溫度稍高的組合A₁B₂C₂D₃，即最佳提取工藝組合2，提取液為甲醇-6mol·l^-1V/V=9：1，料液比1：1.5，提取時間20min.提取溫度為55℃。

2.3 線性范圍與標準曲線

根據李加友的實驗結果，L-瓜氨酸在0～0.04g·L^-1，其吸光度與L-瓜氨酸的質量濃度具有良好的線性關系，經筆者考察，其線性關系因反應煮沸時間、冷卻至室溫時間、避光條件稍有不同就會有變化。其標準曲線Y=k^*X+b，Y為標樣濃度(g·L^-1)，X為490nm處的吸光度的值，k為標準曲線的斜率，為0.0616～0.081，b為標準曲線的截距，為0.0081～0.0217，r為0.998 7～0.9995，所以每次測定都須做標準曲線。西瓜瓤及瓜皮中的L-瓜氨酸的含量為0～4mg·g^-1，故必須把瓜瓤及瓜皮稀釋100倍后再測定。由于在測定過程中已稀釋5倍。只需再稀釋20倍，就能使測定結果在檢出范圍內。

2.4 回收率實驗

采用加樣回收法測定回收率。將西瓜樣品等量分成2份，其中一份加入已知量的L-瓜氨酸標樣，另一份不加以測定本底值。2份樣品分別按前述方法中步驟平行操作，重復5次，測定結果見表2。從表中可看出，L-瓜氨酸平均回收率在99％以上，說明本法的回收率符合定量分析要求，因而可以認為上述的提取及測定條件是可行的。

2.5 測定方法的應用

取同一品種3～5個西瓜，縱切后取瓜瓤或瓜皮100g榨汁(瓜皮用水果刀去表皮2mm后，切成1cm³的塊，加入蒸餾水100mL榨汁)，取榨汁液10g加入提取液15mL，于大試管中搖勻，密封，于55℃下水浴20min。水浴后的樣品倒入50mL的燒杯中，加入10g活性碳脫色(瓜皮無須脫色，直接過濾)，過濾到錐型瓶中備用；取過濾液1mL加入7mL蒸餾水稀釋(瓜皮取過濾液1mL加入1.64mL蒸餾水)，混勻。取稀釋液1mL加入試管中，再加4mL的蒸餾水，然后依次加入2mL混合酸，0.25mL 30g·L^-1二乙酰一肟溶液，搖勻，密封，避光沸水浴反應30min，反應結束后避光冷卻至室溫，于490nm波長測定吸光度。以上實驗操作均在室溫下進行，每個樣品重復測定5次。

用上述提取和測定方法，測定西瓜中瓜瓤及瓜皮中L一瓜氨酸的含量，提取效果較好(表3)。

3 討論

由于L-瓜氨酸無紫外吸收和熒光發射特性，因此要提高L-瓜氨酸分析檢測的靈敏度和分離選擇特性，通常將L-瓜氨酸衍生后進行定量分析。本試驗中L-瓜氨酸的胍基(NH₂CONH，)與尿素的結構(NH₂CONH₂)相似，因此可以在酸性條件下與二乙酰一肟反應，生成紅色化合物。在生物體內的20種蛋白質氨基酸中，精氨酸分子上含有(NH₂C=NHNH)，僅L-瓜氨酸分子上含有胍基(NH₂CONH)。因此，除L-瓜氨酸外，其余氨基酸均不與二乙酰肟發生顯色反應。該方法快速、準確、操作簡便、結果具有良好的線性和準確度，L-瓜氨酸定量分析測定無干擾，適用范圍廣。但是通過筆者反復試驗觀察，本方法有一關鍵步驟必須注意，當二乙酰一肟與L-瓜氨酸在100℃進行顯色反應時，沸水反應時間及反應后冷卻至室溫的時間稍有差異，會直接影響測定結果，因此每次測定必須同時做標準曲線，才能盡量減少誤差。

提取液中加入鹽酸的作用是調節提取液的pH，使提取液呈酸性。因為L-瓜氨酸是水溶性氨基酸，其等電點在pH5.97。當提取液pH在6.0時，L-瓜氨酸主要以兼性離子存在，其靜電荷幾乎為0，此時其溶解性最低，因此提取效果差；當提取液pH離開其等電點時，L-瓜氨酸主要以帶電離子存在，水溶性增大，故提取效果好。當被提取的物質含有果膠、淀粉及色素等物質，在堿性條件下加熱提取，多糖類物質容易糊化，大大增加提取液過濾阻；而且，氨基酸也容易在此條件下發生脫羧和脫氨反應，生成胺及酮酸，胺則進一步再與糖或酮酸發生Maillard反應生成有色物質。在酸性條件下則沒有糊化現象，Maillard反應程度也大大減輕。因此，為了保持色素的天然狀態和產量，宜在酸性條件下提取L-瓜氨酸。

甲醇的沸點為64.5℃，提取時溫度不易過高，否則甲醇易揮發，提取效率反而下降。Agnes等以6m01·L^-1HCl為提取劑，超聲水浴20min，泵人10min N₂，而后樣品加熱到145℃持續4h，這種提取方法的提取回收率為(96.48±0.90)％(RSD=0.93％)，提取效果也較理想。但步驟繁瑣，成本較高。本研究只是對甲醇、乙醇的提取效率進行了比較，是否還有更好的提取劑，需作進一步的研究。

活性炭的作用是脫去瓜瓤的顏色以消除本底顏色對測定結果的影響，實驗證明活性炭對L-瓜氨酸并沒有吸附作用，從這一角度出發，活性炭的用量應該越多越好，但用量過大，含瓜瓤的提取液也會被活性炭吸附而影響過濾的效果，當活性炭從10g增加到15g時，干擾測定結果的色素已被基本吸附完，故本試驗選擇了活性炭用量為10g。瓜皮去表皮后沒有顏色，無須脫色，可提取后直接測定。

瓜皮中含有豐富的L-瓜氨酸，一些品種瓜皮中L-瓜氨酸的含量甚至超過瓜瓤，西瓜食用后瓜皮一般作為垃圾處理，如果利用瓜皮加工提取L-瓜氨酸，則可以變廢為寶以提高西瓜的經濟價值。