CⅢ-1菌株胞外抗菌蛋白防治香蕉炭疽病研究

摘 要：為明確紅樹內(nèi)生細(xì)菌CⅢ-1菌株的抗菌蛋白對香蕉炭疽病的控制作用，采用平板對峙法結(jié)合顯微觀察測定其對致病菌的抑制活性，進(jìn)行抗菌蛋白對香蕉炭疽病的防病試驗(yàn)，并測定了香蕉果實(shí)內(nèi)丙二醛的含量及防御酶活性的變化。結(jié)果表明，CⅢ-1抗菌蛋白粗提液噴霧后立即接種香蕉炭疽病菌，處理8d后其防治效果達(dá)71.44％，10d后防效仍有56.67％；防病機(jī)制測定表明，(1)CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉炭疽病菌的菌絲生長及分生孢子萌發(fā)等具有極強(qiáng)的抑制作用，處理后的病菌菌絲出現(xiàn)腫脹、膨大、成泡囊狀畸形，分生孢子基本不萌發(fā)。(2)抗菌蛋白處理香蕉后，與對照比，抗菌蛋白處理的香蕉丙二醛(MDA)的含量較低，同時(shí)過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等活性也均有不同程度的變化。

關(guān)鍵詞：香蕉；抗菌蛋白；炭疽病；生物防治；機(jī)制

中圖分類號：$668.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)04-580-05

香蕉是華南地區(qū)的大宗果品之一，其營養(yǎng)豐富甜滑香濃，深受人們的喜愛。炭疽病是危害香蕉生產(chǎn)的主要病害之一，嚴(yán)重影響蕉果質(zhì)量與商品價(jià)值。而利用化學(xué)殺菌劑控制病害，會造成嚴(yán)重的污染及危害。我國政府一直對食品安全性高度重視，目前已禁止使用多種化學(xué)殺菌劑，而不使用或者少用化肥農(nóng)藥的綠色水果亦深受廣大消費(fèi)者歡迎，同時(shí)，國外貿(mào)易壁壘也迫使我國必須開發(fā)安全、無公害、高效的果蔬防腐保鮮劑。可見研制微生物防腐保鮮劑對減少果品中農(nóng)藥殘留、保護(hù)環(huán)境、提高經(jīng)濟(jì)效益等多個(gè)方面都具有十分現(xiàn)實(shí)的意義。CⅢ－1菌株是本實(shí)驗(yàn)室從湛江紅樹植物木欖葉片中分離到的1株植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌，該菌產(chǎn)生的胞外抗菌蛋白，對多種動植物病原菌具有較強(qiáng)的拮抗性，且對辣椒青枯病具有較好的防治效果。我們以CⅢ-1菌株產(chǎn)生的抗菌蛋白為研究材料，對其防治香蕉炭疽病的作用及其機(jī)理進(jìn)行研究，為海洋微生物用于香蕉采后病害的生物防治、保鮮制劑的研制與開發(fā)應(yīng)用等提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

供試CⅢ－1菌株：為本實(shí)驗(yàn)室從紅樹植物一木欖(Bruguieragymnorrhiza)葉片體內(nèi)分離獲得的內(nèi)生海洋細(xì)菌，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amy-loliquefaciens)，該菌不僅對番茄青枯菌(Rdstoniasolanacearum)、香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和豬鏈球菌(Streptococcus suis)等多種動植物病原菌具有拮抗作用，而且證明其抗菌物質(zhì)主要是蛋白類，且發(fā)現(xiàn)在33％硫酸銨飽和度下凝聚沉淀提取的菌株胞外蛋白液的抗菌活性最強(qiáng)。為此，研究以33％硫酸銨飽和度下凝聚沉淀提取的CⅢ-1菌株胞外抗菌蛋白液為材料，進(jìn)行試驗(yàn)。供試病原菌香蕉炭疽菌(C.musae)為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

PSA液體培養(yǎng)基，NA培養(yǎng)基，改良PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，葡萄糖20.0g，蛋白胨5g，瓊脂18g，水1000mL，pH自然)。

1.3 抗菌蛋白的制備及濃度測定

挑取平板培養(yǎng)的CⅢ-1菌株單菌落，接種于PSA液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)18h后，按4％接種于PSA液體培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)96h。將培養(yǎng)液在10000r·min^-1條件下離心20min后取其上清液，并用孔徑為0.22um濾膜過濾，用33％硫酸銨飽和度沉淀其蛋白，經(jīng)透析，即為菌株抗菌蛋白提取液，于20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

可溶性蛋白的含量測定采用考馬斯亮藍(lán)顯色法測定抑菌蛋白的濃度。通過蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到濃度。

1.4 CⅢ-1抗菌蛋白防治香蕉炭疽病效果測定

選健康無病、果個(gè)均勻、發(fā)育期基本一致的蕉果，用自來水沖洗表面后，晾干，均勻涂抹抗菌蛋白液，單果分開放入塑料盆中，待果面液體自然晾干后立即噴霧接種香蕉炭疽病分生孢子懸浮液(濃度約10⁶孢子·mL^-1，28℃下保濕培養(yǎng)。以清水PBS緩沖液處理為對照，3d后調(diào)查發(fā)病情況。

1.5 香蕉炭疽病病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)

0級：無病斑；1級：果面有零星病斑，柄部開始變黑，果柄見極少量菌絲；2級：果面病斑較多，病斑數(shù)5～10，柄部基本變黑，出現(xiàn)白色菌絲；3級：果面有大量病斑，柄部全部變黑，出現(xiàn)紅色孢子堆；4級：果面有大量病斑，柄部全部變黑，蕉果開始腐爛；5級：果面布滿病斑，果體松軟腐爛，果柄易折斷。

1.6 CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉炭疽病菌菌絲生長的影響

將香蕉炭疽病菌接種在PDA平板培養(yǎng)基上，對峙點(diǎn)接CⅢ－1菌株抗菌蛋白提取液，培養(yǎng)出現(xiàn)抑菌圈后，挑取菌落邊緣菌絲，鏡檢菌絲生長狀況，以無菌水及0.01mo1·L^-4，pH6.8的PBS緩沖液為對照。

1.7 CⅢ-1抗菌蛋白對病菌分生孢子萌發(fā)的影響

用將CⅢ-1菌株抗菌蛋白溶液(25.99g·L^-1)配制香蕉炭疽病菌分生孢子懸浮液，用載玻片懸滴法28℃下培養(yǎng)24h，以無菌水及PBS緩沖液為對照，計(jì)算分生孢子萌發(fā)率。

1.8 CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉內(nèi)MDA含量及POD和PAL等防御性酶活性測定

設(shè)CⅢ-1菌株抗菌蛋白、PSB緩沖液和清水等3個(gè)處理，選取果實(shí)和處理方法同1.4，處理后每隔24h取1次樣，分別測定各處理香蕉內(nèi)MDA含量、POD和PAL等防御性酶活。其中MDA含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，POD酶活性采用愈創(chuàng)木酚法，PAL酶活性參照陳建勛的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉果炭疽病的防治效果

CⅢ-1抗菌蛋白防治香蕉果炭疽病測定結(jié)果表明(表1)，用CⅢ-1抗菌蛋白涂抹蕉果后立即接種病原菌8、9和10d的防治效果分別為71.44％、57.14％和56.67％，接種12d后抗菌蛋白的防病效果仍有33.33％(資料未顯示)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用抗菌蛋白處理后，不僅病害發(fā)生輕，而且蕉果表面較光滑(圖1)。由此可見，CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉果實(shí)炭疽病具有較好的防治效果，對香蕉具有一定的保鮮作用。

2.2 不同濃度抗菌蛋白提取液對香蕉炭疽病的防治效果

不同濃度蛋白提取液對香蕉炭疽病的防治效果表明(圖2)，蛋白提取液的防病效果與蛋白濃度呈正相關(guān)，蛋白濃度越高，防病效果越明顯。

2.3 CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉炭疽病菌菌絲生長的影響

測定結(jié)果表明(圖3)，對峙生長4d后，香蕉炭疽病菌生長直徑只有(1.15±0.05)cm，而清水及PBS對照香蕉炭疽病菌生長直徑已達(dá)到(5.2±0.1)cm。靠近菌株邊緣處病菌菌絲不僅不能向外擴(kuò)展生長，而且變黑，形成一條黑色條帶，鏡檢發(fā)現(xiàn)其菌絲形態(tài)出現(xiàn)腫脹、膨大、成泡囊狀畸形。說明CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉炭疽病菌菌絲生長有抑制作用。

2.4 CⅢ-1抗菌蛋白對病菌分生孢子萌發(fā)的影響

病菌分生孢子萌發(fā)測定結(jié)果表明，CⅢ-1抗菌蛋白處理后，分生孢子100％不萌發(fā)。而PBS及清水對照中分生孢子的萌發(fā)率分別達(dá)91.5％和95.83％，由此可見，CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉炭疽病孢子的萌發(fā)具有極強(qiáng)的抑制作用。

2.5 丙二醛(MDA)含量測定

各處理蕉果丙二醛(MDA)含量變化測定結(jié)果表明(圖4)，抗菌蛋白處理的蕉果，MDA含量變化平穩(wěn)，且量值均比對照低；處理后7d對照的MDA含量開始迅速上升，這與病害發(fā)生情況基本吻合。表明寄主體內(nèi)MDA含量與寄主細(xì)胞的損傷程度相關(guān)，這與前人研究結(jié)果相符。說明抗菌蛋白處理可降低寄主體內(nèi)MDA濃度的增加，減小病菌對寄主細(xì)胞的損害。

2.6 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定

各處理蕉果體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶(PAL)變化趨勢明顯不同，對照處理PAL酶活均比抗菌蛋白處理的高。對照在處理后9d內(nèi)，其PAL酶活均呈現(xiàn)上升趨勢，而抗菌蛋白處理5d內(nèi)，其PAL酶活呈現(xiàn)下降，之后再上升(圖5)。抗菌蛋白處理的蕉果PAL酶活力曲線趨勢相對平穩(wěn)，說明抗菌蛋白處理后，寄主體內(nèi)各保護(hù)酶類的產(chǎn)生及活性變化不大，對寄主損傷較小，寄主可以保持正常的生理生化狀態(tài)，可見，CⅢ-1抗菌蛋白對寄主保持正常生理生化狀態(tài)，提高寄主抗病性，減輕病害發(fā)生程度具有一定的作用。

2.7 過氧化物酶(POD)活性測定結(jié)果

各處理蕉果過氧化物酶(POD)活力變化結(jié)果表明(圖6)，各處理POD酶活力變化基本相似。無菌水處理后3d達(dá)到高峰，而后迅速下降。其中以無菌水處理的POD酶活曲線整體變化幅度大，說明無菌水處理的POD酶活性變化大，超氧自由基，H_{2O2或者過氧化物產(chǎn)生較多，代謝紊亂，對宿主傷害較大。而抗菌蛋白處理的蕉果，在3d出現(xiàn)酶活高峰后緩慢下降并保持在較低水平，蕉果保持正常的代 謝生理狀態(tài)，說明CⅢ-1菌株抗菌蛋白對提高宿主抗病能力可能具有一定的作用。}

3 討論

關(guān)于果蔬采后病害生物防治的生防菌，目前多來源于植物體內(nèi)或其體表。國內(nèi)外對拮抗菌控制采后病害研究最多的是酵母菌、假單孢菌及芽孢桿菌。其中，芽孢桿菌是一類在自然界廣泛存在的重要微生物類群，其突出的特征是能產(chǎn)生抗逆性極強(qiáng)的芽孢，這有利于芽孢桿菌作為生防菌株的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖和繁殖，而將海洋微生物用于果蔬采后病害防治，目前還未見有相關(guān)報(bào)道。近年來的研究表明，海洋中不僅存在著可以分泌產(chǎn)生大量具有生物學(xué)活性的物質(zhì)微生物，甚至許多以前認(rèn)為是由海洋植物或無脊椎動物產(chǎn)生的活性物質(zhì)，其真正來源是由與之共附生的微生物所產(chǎn)生的。關(guān)于海洋微生物活性物質(zhì)，近年來已開始有將海洋微生物用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的研究報(bào)道。紅樹林及其共附生海洋微生物，目前已有研究報(bào)道，紅樹生態(tài)系統(tǒng)是海洋微生物生長繁衍的溫床，其體內(nèi)外及根際土壤中均存在有大量的微生物，本實(shí)驗(yàn)室從紅樹林多個(gè)品種中分離篩選到大量對植物病原菌具有良好抑制作用的海洋細(xì)菌，表明了紅樹共附生微生物不僅數(shù)量、種類多，且在植物病害生防中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

實(shí)驗(yàn)采用來源于紅樹植物木欖葉片內(nèi)生細(xì)菌CⅢ-1胞外抗菌蛋白為實(shí)驗(yàn)材料，對CⅢ-1胞外抗菌蛋白防治香蕉采后炭疽病進(jìn)行了研究，獲得良好的防病效果。由此可見，紅樹內(nèi)生細(xì)菌可能具有十分重要的研究和開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，對此值得進(jìn)一步研究，為海洋微生物在農(nóng)業(yè)病蟲害生物防治中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。