梨遺傳連鎖圖譜的構建及部分果實性狀QTL的定位

摘 要：利用八月紅梨和碭山酥梨雜交得到的F₁。代實生苗為作圖群體，應用J0inmap 3.0作圖軟件，構建了一張包含61個蘋果EST—SSR標記、68個蘋果SSR標記、49個梨SSR標記、1個RAPD標記和3個質量性狀標記，共182個標記并分屬于19個連鎖群的梨遺傳連鎖圖譜，圖譜總長度為982cM，標記間平均圖距5.4cM。控制果皮紅色的基因RFS位于LG3連鎖群上，與最近的分子標記MES93-264p的遺傳距離分別為9cM?？刂乒P存在的基因FR、控制萼片脫落性狀的基因As分別位于LGl6連鎖群和LGl2連鎖群上。采用區間作圖法，檢測到與果實可溶性固形物含量、單果質量、橫徑和縱徑等性狀連鎖的QTL位點21個(LOD≥2.5)，其中主效QTL位點6個(LOD≥3.5)，與果實性狀相關QTL位點多集中在LG7和LGll連鎖群上。

關鍵詞：梨；SSR；EST—SSR；遺傳圖譜；QTL分析；果實性狀

中圖分類號：S661-2 文獻標識碼：A 文章編號：1009—9980f2010104—496—08

梨(Pyrus L)是中國重要的果樹之一，其栽培面積和產量僅次于柑橘和蘋果，位居第3位。為了梨產業的可持續發展，培育品質好和抗性強等綜合性狀優良的新品種非常必要。由于梨的童期較長。利用傳統的育種技術選育新的品種需要很長的時間。利用分子標記輔助選擇(MAS)育種技術無疑可以提高選擇效率，加快育種步伐。而高質量的遺傳連鎖圖譜可以進行基因定位、檢測和分析數量性狀的位點(QTLs)，是MAS的基礎。

目前，有關梨遺傳圖譜的構建的研究主要集中在西洋梨和日本梨上。已經在巴梨(Bartlett)、幸水梨(Kousui)、巾著梨(Kinchaku)和豐水梨(Housui)等品種上建立了遺傳連鎖圖譜。但早期構建的所用的F₁群體較小，所構建的連鎖群大于梨的染色體基數17。Yamamoto等構建的Bartlett遺傳圖譜由447個標記，17個連鎖群構成，圖譜總長1 000 cM。Terakami等整合構建了豐水梨遺傳圖譜，覆蓋梨基因組1174cM，由17個連鎖群，335個標記構成，分子標記之間的平均距離為3.5cM。

梨多數重要性狀特別是與果實品質有關的性狀是受多基因控制的數量性狀(QTL)，但目前有關梨QTL定位的報道很少，在其他果樹，關于果實的QTL定位已經取得了部分成果。Wang等對控制櫻桃的單果質量和可溶性固形物的QTL位點進行了定位。King等發現與蘋果果實硬度相關的QTL位點分別分布在7個連鎖群上。Didewanger等對桃果實質量量、可溶性固形物的含量、果實糖含量、果實pH、可滴定酸含量等進行了定位，發現具有相關功能的QTL位點成簇分布。

我國梨遺傳連鎖圖譜構建和QTL定位的研究起步較晚，到目前為止，僅有孫文英等用鴨梨和京白梨的₁，群體建立了主要由AFLP標記組成的梨遺傳圖譜和對與梨生長性狀相關的QTL進行的定位。針對目前關于梨果實QTL定位研究的空白，更好地從分子水平上研究梨果實數量性狀位點遺傳規律，我們利用包括自行開發的蘋果EST-SSRtnl等在內的蘋果及梨的多種SSR標記，利用在果實性狀上存在較大差異的八月紅梨和碭山酥梨雜交得到的F₁群體構建梨分子標記連鎖圖譜，對控制梨果實質量性狀的基因進行了定位，并采用MapQTL4，0軟件，選用區間作圖法(interval mapping)對控制可溶性固形物含量、單果質量、橫徑、縱徑的4種果實性狀的OTL進行了分析和定位。

1 材料和方法

1.1 材料

以八月紅梨為母本、碭山酥梨為父本雜交得到的91株F₁為作圖群體。雜交群體種子于2001年春天在中國農業科學院鄭州果樹研究所播種，2005年結果，2006—2007年對果實的著色、單果質量(Mass of single fruit，MSF)、橫徑 (Transverse diameter 0f fruit，TDF)、縱徑(Vertical diameter of fruit，VDF)、可溶性固形物含量(Total soluble solids concentra-tion，SSC)進行連續2a的測定。

1.2 總DNA的提取

于2008年采集雜交群體及親本的新鮮幼葉，用改良SDS法提取基因組DNA。

1.3 SSR引物的篩選和分析

研究共選用了154對引物，其中80對為蘋果基因組SSR引物，34對為梨基因組SSR引物，40對為本研究小組基于蘋果EST庫開發，且證明在梨屬上具有轉移性和多態性良好的EST-SSR引物。PCR反應體系為20μL，組分及濃度分別為：1 xPCR buffer，1.5mmol·L^-1MgCl₂0.2 mmol·L^-1dNTPs，0.5mmol·L^-1上下游引物，0.5mg·L^-1模板DNA，0.05U·μL^-1Taq DNA聚合酶。PCR反應程序參照原文獻。選取2個親本進行154對引物的初步篩選，在親本中有多態性的引物用于整個F1代群體中進行擴增。一部分SSR擴增產物用傳統聚6％變性丙烯酰胺凝膠電泳并進行銀染㈣，以已知分子量marker(PBR322／Msp I marker)估算每條譜帶的分子量。另一部分標記通過合成熒光引物，上游引物為普通引物，下游引物加入了熒光染料(FAM或者HEX)，擴增產物用雙蒸水稀釋到合適的濃度，在浙江大學分析測試中心，以Marker ET550-R為標準，使用MegaBACE 1000 DNA測序儀(Amersham Bio—sciences)測定產物片斷大小，測序結果使用軟件Genetic Proffer 2.0進行分析。

1.4 RAPD引物篩選和分析

選取S519、S1289、S2107和S12354個RAPD引物，PCR反應體系和程序參照原文獻。PCR反應物經2，5％瓊脂糖膠(EB 0.5mg·L^-1)電泳檢測，電壓為4～5V·Cm^-1，以已知分子量(marker Gene Ruler100bp DNA ladder plus)估算每條譜帶的分子量，紫外透射反射分析儀上觀察照相。

1.5 數據統計及圖譜構建

使用SPSS軟件計算單果質量、橫徑、縱徑和可溶性固形物含量4個性狀的平均值、標準差、偏態值和峰度值以及4個性狀之間的相關性。對RAPD、SSR結果進行統計，有帶(峰)的記為1，無帶(峰)的記為0，缺失的記為一，采用“引物組合+分子量”表示，后綴P、m、f分別表示父母共同帶、母本特征帶、父本特征帶。把果皮紅色性狀(red fruit skin，RFS)、有果銹(fruit russeting，FR)、萼片脫落性狀(abscis—sion 0f sepals，AS)分別看作一個形態學標記，用“1”表示，相對應地將果皮非紅色，無果銹，以及萼片宿存或殘存的性狀記作“0”。按照JoinMap 3.0軟件對數據格式的要求將原始數據矩陣進行統一轉換，計算連鎖群體。結合MapQTL 4.0軟件進行區間作圖，進行數量性狀的QTL定位，將LOD≥2.5作為QTL位點的入選臨界值。

2 結果與分析

2.1 SSR的多態性分析

研究共篩選出92對引物，包含了28對蘋果EST-SSR引物、43對蘋果SSR引物、21對梨SSR引物，共產生197個等位基因，平均每條引物產生2.1個等位基因，對這些多態性位點的標記分離比例進行統計，共有25個等位基因表現為偏孟德爾分離(X²<0.01)，頻率為12.69％，其中嚴重偏分離標記沒有用于連鎖群體的構建。

2.2 梨遺傳圖譜的構建

利用Joinmap 3.0作圖軟件分析分子標記的分離比例并進行標記之間的連鎖分析，構建了一張共包含182個標記的的梨后代遺傳圖譜，其中包含了61個蘋果EST-SSR標記、68個蘋果基因組SSR標記、49個梨基因組SSR標記、1個RAPD標記，3個質量性狀標記，分屬19個連鎖群的梨遺傳連鎖圖譜(圖1)。各連鎖群的LOD值在3.0～8.0，圖譜總長度覆蓋梨基因組982cM，各連鎖群標記間平均距離在2.6～9.7cM，整個連鎖群的平均距離為5.4cM；各連鎖群的長度在30～76cM。其中LGl9最短，LGll最長；不同連鎖群上的標記數在6～14個，其中7個連鎖群所含標記數目大于10個。

2.3 果皮紅色·陛狀、果銹及萼片脫落，宿存性狀的定位

在91株后代群體中，71.4％個體的果皮表現為非紅色，28.6％個體的果實表現為紅色，卡方檢驗X²0.619(X²0.05=3.841，X²20.05)，符合3:1的分離比例；47.2％個體的果實表現為有果銹，52.8％的個體的果實表現為無果銹，卡方檢驗X²=0.275(x²=3.841，Xx²20.05)符合1:1的分離比例；77.7％個體的萼片表現為脫落，22.2％個體的表現為萼片宿存或殘存，卡方檢驗X²=0.443(x²0.05=3.841，x²20.05)，符合3:1的分離比例。該F₁。代雜交群體中這3種性狀均表現為孟德爾單基因遺傳規律，可進行圖譜定位分析。

如圖1所示，控制果皮紅色的基因RFS位于連鎖圖第3連鎖群上，并與標記S519以及MES₉₃264p相連鎖，遺傳距離分別為10cM和9cM：控制果銹有無的基因FR位于連鎖圖第16連鎖群上，并與標記CH01H01-107p連鎖，遺傳距離為5cM：控制萼片脫落與宿存性狀的基因AS位于連鎖圖第12連鎖群上，并與標記CH02F06-195m連鎖，遺傳距離為4cM。

2，4 果實性狀在F_１。群體中分離與相關性分析

研究所選親本在果實外形和品質等方面有著一定的遺傳差異，通過對91株雜交后代的分離性狀分析表明：可溶性固形物含量、單果質量、橫徑和縱徑4個性狀均為連續分布，其平均值、峰度、偏度檢測如表1所示，各個性狀的頻率分布如圖2，基本接近正態分布，可用作QTL定位研究。分析表明這4個性狀的峰值數值較小，均非常接近0.5；4個果實性狀在作圖群體中兩兩之間均表現出了極顯著的相關性，正相關系數r=0.956^**～0.992^**(**表示在1％的概率水平上有極顯著相關性)。

2.5 果實性狀QTL的定位

采用MapQTL4.0軟件，選用區間作圖法對控制可溶性固形物含量(SSC)、單果質量(WSF)、果實橫徑(TDF)、果實縱徑(VDF)的QTL進行了分析。通過分析共檢測到21個QTL，分別被定位在9個連鎖群上(圖1)，其中主效QTL位點有6個(LOD≥3.5)。其QTL在連鎖群上的分布見表2。

定位結果顯示，控制單果質量、橫徑、縱徑、可溶性固形物含量的QTL位點主要集中在7號、11號、16號連鎖群上，并且相距很近或重疊的較多。在LG7中，共有7個QTL位點，其中控制單果質量、橫徑和縱徑分別有2個、2個和3個QTL位點。WSF-1和VDF-1兩個QTL位點接近，并且與MES₄₆-115f表現為共分離，這些結果表明單果質量的增加主要取決于果實橫徑和縱徑的增加，橫徑和縱徑對單果質量的貢獻都很大。在11號連鎖群上共有5個QTL位點，其中控制單果質量、橫徑、可溶性固形物含量的QTL位點相近或重疊的較多，TDF-4和SSC-4兩個QTL位點是重疊的，與最近的分子標記距離為3.2cM，QTL位點的相關性說明可溶性固形物含量與單果質量性狀之間有一定的相關性。在2號連鎖群上，檢測到TDF-1和SSC-1兩個QTL位點相距很近，它們與最近的分子標記CH02810-110f的距離都是1.2cM和1.7cM。

在7號、11號、14號連鎖群上分別檢測到1個控制單果質量的主效QTL，LOD值分別為4.19、3.93、3.54，可解釋分別為33.1％、30.6％、26.6％的表型變異，與最近的分子標記的距離分別在0.4cM～3.8cM。在11號連鎖群上，檢測到一個與Hi22f06-229f共分離的控制單果質量的微效QTL，可解釋16.7％的表型變異。

在2號連鎖群上，檢測到一個控制橫徑的主效OTL位點TDF-1，LOD值為3.60，可解釋26.2％的表型變異，與最近的分子標記的距離CH02810-110f為1.2cM。在7號連鎖群上檢測到1個控制縱徑的主效QTL位點VDF-2，LOD值為3.88，可解釋24.0％的表型變異，與最近的分子標記的距離為5.0cM。在10號連鎖群上檢測到1個控制可溶性固形物含量的QTL位點SSC-3，LOD值為4.50，可解釋22.7％的表型變異，與最近的分子標記的距離CH04c07-150m為5.0cM。

另外檢測到控制單果質量、橫徑、縱徑、可溶性固形物含量的其他15個QTL位點的LOD值均沒有達到3.5，可解釋表型變異相對較小，認為是微效QTL位點，它們與最近標記的距離在0.4～5.0cM。

3 討論

3.1 對所構建的梨遺傳圖譜的分析評價

研究利用Joinmap3.0作圖軟件構建了一張分屬19個連鎖群的梨遺傳連鎖圖譜。從總體來看，所構建的圖譜各標記分布比較均勻。在構建的遺傳連鎖圖上，部分SSR標記的連鎖群分布以及在連鎖群上的排列次序與Yamamoto等、MaIiepaard等和Liebhard等發表的蘋果遺傳圖譜是一致的，各標記間的遺傳距離由于作圖群體和作圖軟件等不同而存在差異。

分子連鎖群是植物染色體在分子水平上的反映。理論上，分子連鎖群的數目應該和相應染色體的數目一致。梨為二倍體，染色體數目X=17，而本研究所構建的連鎖群體有19個。在其他研究者構建的梨遺傳圖譜上也有類似問題。如Yamamoto等構建的Bartlett圖譜有18個連鎖群。Iketani等引在日本梨Kinchaku和Kosui上分別構建了含有18個和22個連鎖群的遺傳圖譜。造成這種狀況的主要原因有以下幾點：第一。所選用的分子標記在染色體上分布的隨機性以及染色體不同區段交換值異質性的存在，導致連鎖群斷開；第二，該選用的標記數目太少，尚未完全覆蓋整個梨的基因組；第三，在構建圖譜時，對于卡方測驗偏離1:1或3:1以及缺少15％以上株系數據的SSR標記均未使用。

SSR標記呈共顯性，在基因組中含量豐富，可作為錨定標記，有助于圖譜連鎖群的歸并和不同連鎖群的整合。本研究小組首次將自行開發的蘋果EST-SSR引物成功地定位到了梨的圖譜上。目前國外雖構建了梨的連鎖圖但尚未建立公共圖譜，無公共的標記可利用，所以己構建的這些連鎖群和17條染色體不能一一對應，因此今后為了構建高密度的遺傳圖譜，應當與其他多種分子標記手段相結合，完善遺傳圖譜。

3.2 關于果皮紅色性狀標記的定位

目前，還沒有關于梨果皮紅色性狀標記的定位。在本研究中，我們將控制果皮紅色的性狀標記RFS定位于第3連鎖群上，并與標記S519以及MES93-264p相連鎖，遺傳距離分別為10cM和9cM。Weeden等的研究認為，果樹上控制果皮中花青苷合成的基因位于第3連鎖群上。本研究將控制果皮顏色的基因RFS位于連鎖圖第3連鎖群上，與控制果皮中花青素的基因在同一連鎖群。

目前在蘋果上，已經尋找到與果皮紅色基因相連鎖的分子標記。Cheng等獲得了與蘋果果皮色澤相關的分子標記，并且也開發出一對通用性PCR引物。趙靜等圳在蘋果中發現S519在1000bp左右可以擴增出的一條與紅色性狀相關的DNA特異帶，我們也將該標記成功地轉移到梨圖譜上。本研究得到的2個與紅色性狀相連鎖的標記，遺傳距離相對較遠，在實際應用中有一定的局限性。今后的工作應該通過加密圖譜的方法得到與該性狀連鎖更為密切的標記，從而進行目標區域的基因克隆。

3.3 梨果實性狀的QTL定位及其相互關系

控制某一性狀的QTL大多聚集在同一連鎖群的相近或相同區域內。本研究定位結果顯示，控制單果質量、橫徑、縱徑、可溶性固形物含量的QTL位點主要集中在某一染色體上，并且相距很近，例如，控制單果質量的QTL主要集中在LG7和LGll上，控制橫徑、縱徑QTL主要集中在LG7，而控制可溶性固形物含量的QTL要集中在LGll上。

植物中普遍存在著具有相關功能的基因成簇分布或者是共分離現象。本研究在LG7上檢測到控制單果質量WSF-1和控制縱徑VDF-1兩個QTL位點是共分離的，并且與MES₄₆-115f表現為共分離：在LGll上，控制橫徑的TDF-4和控制可溶性固形物的SSC-4兩個QTL位點表現為共分離。在LG2上，檢測到TDF-1和SSC-1兩個QTL位點相距很近，它們與最近的分子標記CH02810-110f的距離分別是1.2cM和1.7cM。在其他植物上也存在著具有相關性的性狀的QTL位點緊密連鎖的或者聚集的現象。

3.4 主效QTL位點與MAS

MAS是利用目標性狀基因與分子標記之間緊密連鎖關系進行間接選擇。MAS不受其他基因效應和環境因素的影響，結果可靠，適用于對目標性狀進行早期選擇。本研究中利用分子遺傳圖譜檢測到了21個與梨果實性狀相關的QTL位點，并且檢測到與這些QTL位點呈共分離或緊密連鎖的分子標記，有望通過標記輔助選擇對這些重要位點進行遺傳操作。如本研究中檢測到一個與控制單果質量主效QTL位點WSF-1緊密連鎖的標記MES₄₆-115f.2者之間的遺傳距離為0.4cM。

由于不同性狀的QTL位點是緊密連鎖的，QTL位點之間還存在著互作，利用標記進行選擇時，還要考慮對其他性狀的影響。另外數量性狀基因與環境間存在互作，所以要保證定位的QTL準確性，還要嚴格地對影響各性狀的環境因素進行控制。因此在定位QTL位點時，還需要分析多年、多點等多種環境條件作圖群體，擴大作圖群體，增加標記個數，精準定位QTL區域，為育種工作提供可靠的依據。

4 結論

以八月紅梨和碭山酥梨雜交得到的F₁實生苗為材料，構建了包含61個蘋果EST-SSR標記、68個蘋果SSR標記、49個梨SSR標記、1個RAPD標記和3個質量性狀標記，共182個標記分屬于19個連鎖群的梨遺傳連鎖圖譜，并對控制果實可溶性固形物含量、單果質量、橫徑、縱徑的QTL位點進行了分析和定位。分析表明這4種果實性狀之間存在著極顯著相關性，檢測到與性狀連鎖的QTL位點21個，其中主效QTL位點6個(LOD≥13.5)，與果實性狀相關的農藝性狀QTL位點多集中在LG7和LGll，這些主效QTL位點為分子輔助選擇(MAS)提供了便利。