白肉枇杷與紅肉枇杷成熟果實(shí)可溶性糖組成差異及其與蔗糖代謝相關(guān)酶活性的關(guān)系

摘 要：比較了甜種、荸薺種和冰糖種白肉枇杷以及寶珠、大葉楊墩和大玫瑰紅袍紅肉枇杷成熟果實(shí)果肉的可溶性糖含量、組成及蔗糖代謝相關(guān)酶活性的差異。結(jié)果顯示白肉枇杷果肉可溶性總糖含量高于紅肉枇杷，且以蔗糖為主(占60％～70％)，其次是果糖(20％～30％)和葡萄糖(9％～11％)，而紅肉枇杷中3種可溶性糖的含量比較接近。白肉枇杷果肉蔗糖占總糖的比例顯著高于紅肉枇杷，而葡萄糖則相反，但果糖占總糖的比例在2類枇杷中比較接近。白肉枇杷果實(shí)中性轉(zhuǎn)化酶(NI)、酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)、蔗糖合成酶合成方向(SUS-synthetic)和蔗糖合成酶分解方向(SUS-cleavage)活性均低于紅肉枇杷，蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性則比較接近。2類枇杷果肉蔗糖代謝酶的凈活性均為負(fù)值，但紅肉枇杷酶的凈活性較低。研究認(rèn)為，蔗糖代謝酶活性與2類枇杷果肉可溶性糖含量和組成差異存在密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞：白肉枇杷；紅肉枇杷；可溶性糖；轉(zhuǎn)化酶；蔗糖合成酶：蔗糖磷酸合成酶：凈活性

中圖分類號(hào)：S667.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1D09－9980f(2010)04-616-06

枇杷(Eriobotryajaponica Lindl.)原產(chǎn)我國(guó)，根據(jù)果肉顏色大致可分為紅肉枇杷和白肉枇杷2種類型。白肉枇杷果實(shí)因其品質(zhì)優(yōu)異、價(jià)格高．在浙江和江蘇等地發(fā)展迅速。糖含量與組成是枇杷果實(shí)重要品質(zhì)性狀，研究顯示山梨醇是枇杷果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過程中糖運(yùn)輸主要形式，其含量隨著果實(shí)成熟快速下降，而蔗糖、葡萄糖和果糖等持續(xù)積累，果實(shí)采后貯藏過程中糖含量與組成的變化主要表現(xiàn)為蔗糖水平的持續(xù)下降。然而有關(guān)紅肉枇杷和白肉枇杷果實(shí)糖代謝方面的比較僅見于倪照君等的報(bào)道，他們主要分析了雞蛋白和霸紅等枇杷果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中蔗糖代謝相關(guān)酶的活性，發(fā)現(xiàn)果實(shí)膨大期是糖代謝發(fā)生轉(zhuǎn)變的重要時(shí)期。本文旨在從不同品種資源間的差異人手．通過比較白肉枇杷與紅肉枇杷成熟果實(shí)的糖組成及其相關(guān)酶活性差異，進(jìn)一步闡述枇杷果實(shí)糖轉(zhuǎn)化的內(nèi)在機(jī)制，為研究品質(zhì)形成與改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試果實(shí)中自肉枇杷品種采自江蘇省蘇州市東山鎮(zhèn)．包括甜種，荸薺種和冰糖種3個(gè)品種，紅肉枇杷采自浙江省杭州市塘棲鎮(zhèn)，包括寶珠，大葉楊墩和大玫瑰紅袍3個(gè)品種。選取大小均勻，無機(jī)械傷的果實(shí)進(jìn)行基本生理指標(biāo)測(cè)定。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包括6個(gè)果實(shí)。果實(shí)混合樣品經(jīng)液氮研磨后，置于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 色差測(cè)定 用MiniScan XE PLUS型色差計(jì)(HunterLab，美國(guó))測(cè)定枇杷果皮赤道面對(duì)稱部位的L(明亮度)，a(紅綠偏差)和b(黃藍(lán)偏差)值，并按下述公式計(jì)算色澤指數(shù)(CCI)：CCI=1000×a/(L×b)。

1.2.2 類胡蘿卜素測(cè)定按周春華等[1]的方法測(cè)定。

1.2.3 可溶性固形物測(cè)定 用數(shù)顯糖度計(jì)(ATAGOPR-101a．日本)測(cè)定果實(shí)可溶性固形物(SSC)值。

1.2.4 可溶性糖提取和HPLC分析 參照張望舒等方法，每個(gè)重復(fù)稱取3.0g來自6個(gè)果實(shí)的混合樣品．加入80％乙醇，室溫下10000r·min^{-1離心15min．上清液定容至25mL，用于HPLC(Beckman，美國(guó))測(cè)定可溶性糖含量。重復(fù)3次。色譜條件為：Intertsil氨基柱(4.6mm×250 mm)，柱溫25℃；流動(dòng)相為乙腈：水=80：20(V：V)，流速為1.0mL·min-1；RI-1530示差檢測(cè)器；System Gold系統(tǒng)。}

1.2.5 酶的提取 參照趙智中等方法并略加改進(jìn)。每個(gè)重復(fù)稱取1.0g果肉置于冰浴試管中，加入4.0mL預(yù)冷的提取緩沖液。提取緩沖液成分為50mmol·L^{-1HEPES-NaOH(pH7.5)，10mmol·L-1MgCl₂，1.0mmol·L-1EDTA，2.5mmol·DTT，0.05％(V/V)Tri-tonX-100，0.1％(w/v)BSA，0.1％β-巰基乙醇和2％PYPP?；靹蚝笕?.0mL酶的粗提液在2℃透析20h，透析后的酶液用于酶活測(cè)定。}

1.2.6 酶活性的測(cè)定 酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)活性的測(cè)定按照Lowell等的方法并加以改進(jìn)。反應(yīng)體系含80mmol·L^{-1醋酸一磷酸鉀緩沖液(pH4.5)，150mmol·L-1蔗糖，0.1mL酶液，冷卻后測(cè)定A₅₄₀。中性轉(zhuǎn)化酶(NI)活性的測(cè)定與AI基本一致，但使用的醋酸一磷酸鉀緩沖液pH為7.5。蔗糖合成酶分解方向活性(SUS-cleavage)的測(cè)定參考趙智中的方法，37℃反應(yīng)40min，冷卻后測(cè)定A₅₄₀。對(duì)照的反應(yīng)體系中不含UDP(尿苷二磷酸)。蔗糖合成酶合成方向活性(SUS-synthetic)的測(cè)定參考趙智中等和張秀梅等方法。反應(yīng)體系中含50mmol·L-1HEPES-NaOH(pH7.5)，5.0mmol·L-1 MgCl₂，3.0mmol·L-1果糖，3.0mm01．L-1，UDPG(尿苷二磷酸葡萄糖)，酶液，40℃反應(yīng)20min，冷卻后測(cè)定A₆₂₀。對(duì)照的反應(yīng)體系中不含果糖和UDPG。蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性測(cè)定的操作步驟與蔗糖合成酶合成方向活性基本相同，只是反應(yīng)體系改為100 mmol·L-1 HEPES-NaOH(pH7.5)．5.0 mmol·L-1 MgCl₂，1.0mmol·L～EDTANa_{2，4.0mm01.L。果糖-6-磷酸，3.0 mmol·L-1UDPG，酶液。對(duì)照的反應(yīng)體系中不含果糖-6-磷酸和UDPG。}}

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 使用Origin軟件(V8.00，Micro-cal Software Inc.，Northampton，MA，USA)計(jì)算平均值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種枇杷果實(shí)基本品質(zhì)指標(biāo)比較

試驗(yàn)中2類枇杷果實(shí)的色澤用CCI值來表示。由表1可以看出，白肉枇杷的CCI值明顯低于紅肉枇杷，前者平均值為4.17，而后者為8.50，2者達(dá)到極顯著水平差異(P<0.01)。同時(shí)，白肉枇杷果實(shí)果肉組織的類胡蘿卜素含量也顯著低于紅肉枇杷果實(shí)，表明兩類枇杷果實(shí)色澤的生化組成具有差異。白肉枇杷的SSC高于紅肉枇杷，前者平均值為16.73％，后者為13.42％，2者有顯著差異(P<0.05)。

2.2 不同品種枇杷果實(shí)可溶性糖含量比較

枇杷果實(shí)中可溶性糖主要包括果糖、葡萄糖和蔗糖，并含有少量的山梨醇。在本研究中，荸薺種和寶珠枇杷果實(shí)的山梨醇含量低于檢測(cè)水平．其他4個(gè)品種果實(shí)的山梨醇含量也較低(圖1)。2類枇杷在總糖含量及其組分上有較大差異，甜種、荸薺種和冰糖種等白肉枇杷的總糖含量均高于寶珠、大葉楊墩和大玫瑰紅袍等紅肉枇杷，其中以白肉枇杷中的冰糖種為最高，為171.35mg·g^{-1，2類枇杷的總糖含量具有顯著性差異(P<0.05)，紅肉枇杷總糖約為白肉枇杷果實(shí)的75％。}

從糖組分看，白肉枇杷果實(shí)以蔗糖為主，占總可溶性糖的60％～70％，其次是果糖(20％～30％)，葡萄糖含量較低(9％～1％)。紅肉枇杷果實(shí)中蔗糖、果糖和葡萄糖含量相對(duì)接近，分別占總糖的30％～40％．20％～35％和25％～40％。白肉枇杷品種果實(shí)蔗糖平均含量為105.92mg·g^{-1，而紅肉枇杷果實(shí)為48.35mg·g-1，2者具有極顯著差異(P<0.01)。紅肉枇杷果實(shí)葡萄糖含量平均為38.83mg·g-1，約占總糖含量的35％，白肉枇杷的平均含量為15.70mg·g-1，所占比例約10％，可見紅肉枇杷果實(shí)葡萄糖含量明顯高于白肉枇杷。另外，白肉枇杷果實(shí)和紅肉枇杷果實(shí)的果糖含量相對(duì)接近，分別占總糖的24％和26％。}

為了便于比較白肉枇杷和紅肉枇杷果實(shí)的甜度，我們將葡萄糖和蔗糖換算為果糖甜度(表2)。結(jié)果顯示，白肉枇杷的總甜度高于紅肉枇杷，其中以冰糖種為最高，達(dá)到107.80，大玫瑰紅袍最低，甜度為68.60。白肉枇杷品種間總甜度差別較大，紅肉枇杷品種間總甜度基本接近。白肉枇杷中蔗糖含量對(duì)總甜度的貢獻(xiàn)率較大，約為58％，高于紅肉枇杷的38％。同時(shí)，表2也顯示紅肉枇杷果實(shí)的果糖和葡萄糖對(duì)總甜度的貢獻(xiàn)率高于白肉枇杷果實(shí)。

2.3 枇杷果實(shí)糖代謝相關(guān)酶的活性比較

蔗糖代謝的合成相關(guān)酶包括蔗糖合成酶合成方向(SUS-synthetic)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)，而蔗糖分解相關(guān)酶包括酸性轉(zhuǎn)化酶活性(AI)，中性轉(zhuǎn)化酶(NI)和蔗糖合成酶分解方向(SUS-cleavage)。蔗糖合成酶類活性與蔗糖分解酶類活性之差代表蔗糖相關(guān)酶的凈活性(凈活性)。表3顯示，6個(gè)枇杷品種果實(shí)的凈活性均為負(fù)值，表明成熟枇杷果實(shí)中蔗糖的分解能力較強(qiáng)。

2.4 蔗糖分解酶類活性比較

轉(zhuǎn)化酶根據(jù)反應(yīng)所需的最適pH可分為AI和NI，結(jié)果表明枇杷果實(shí)的AI活性平均為21.05umol·h^{-1·g-1，NI活性為15.44/mol·h-1?！-1。將單個(gè)品種酶活性平均值作為重復(fù)測(cè)量值來計(jì)算，結(jié)果顯示2類轉(zhuǎn)化酶活性在紅肉和白肉枇杷間有差異，紅肉枇杷的AI活性平均為25.12Ixmol·h-1·g-1，白肉枇杷為16.98umol·h-1·g-1(圖2-A)，而2類枇杷果實(shí)的NI活性分別為16.83 umol·h-1·g-1和14.05umo1．h-1·g-1(圖2-B)。SUS在UDP存在條件下催化蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖。檢測(cè)結(jié)果顯示，紅肉枇杷的蔗糖合成酶分解活性為26.09umol·h-1·g-1，白肉枇杷的為13.07umolh-1·g-1，2者差異極顯著(P<0.01)(圖2-C)?？傮w而言，白肉枇杷果實(shí)的蔗糖分解酶類活性低于紅肉枇杷果實(shí)(圖2-D)。}

2.5 蔗糖合成酶類活性比較

SUS催化的蔗糖水解反應(yīng)為可逆反應(yīng)，它在UDPG存在條件下可催化果糖轉(zhuǎn)化為蔗糖，促進(jìn)蔗糖積累。將單個(gè)品種酶活性平均值作為重復(fù)測(cè)量值來計(jì)算，結(jié)果顯示，紅肉枇杷果實(shí)SUS-synthetic活性平均值為8.50umol·h^{-1·g-1，白肉枇杷果實(shí)的平均值僅為1.91uzmol·h-1·g-1(圖3-A)，差異極顯著(P<0.01)。SPS在UDPG存在的條件下催化果糖-6-磷酸形成蔗糖-6-磷酸。檢測(cè)結(jié)果表明紅肉和白肉枇杷果實(shí)的SPS活性水平相近，2者平均值分別為5.57 umol·h-1·g-1和5.03umol·h-1·g-1(圖3-B)。由于紅肉枇杷果實(shí)中較高的SUS-synthetic活性，使得該類型枇杷果實(shí)的蔗糖合成酶類活性明顯高于白肉枇杷(圖3-C)。}

紅肉枇杷蔗糖分解酶類活性和蔗糖合成酶類活性平均值分別為68.38 umol·h^{-1·g-1和16.06umol·h-1·g-1，均高于白肉枇杷的44.10umol．h-1·g-1和6.94umol．h-1g-1差異極顯著(P<0.01)(圖2-D，圖3-C)。然而紅肉枇杷果實(shí)蔗糖酶凈活性平均值為-52.65 umol·h-1·g-1，顯著低于白肉枇杷的-37．16umol．h-1·g-1(表3)。}

2.6 蔗糖含量與糖代謝相關(guān)酶活性的相關(guān)性

表4為6個(gè)枇杷品種果實(shí)蔗糖含量與糖代謝相關(guān)酶活性的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，枇杷果實(shí)NI活性，蔗糖分解酶類活性與蔗糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，AI活性，SUS活性(包括分解方向與合成方向)，蔗糖合成酶類活性均與蔗糖含量具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，SPS活性與蔗糖含量則無顯著相關(guān)性，而酶凈活性與枇杷果實(shí)的蔗糖含量表現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

3 討論

本研究顯示枇杷果實(shí)總糖含量約為120～170mg·g^{-1，接近于已有的報(bào)道_。同屬于薔薇科植物的蘋果、梨、桃、杏和李等果實(shí)，它們總糖含量約為70～180mg·g-1，與枇杷果實(shí)相近。同時(shí)，本研究顯示白肉枇杷和紅肉枇杷果實(shí)在糖含量與組成方面存在差異。白肉枇杷果實(shí)總糖含量顯著高于紅肉枇杷果實(shí)，轉(zhuǎn)換成果實(shí)甜度也明顯高于紅肉枇杷果實(shí)。從糖組分上看，白肉枇杷主要積累蔗糖，占可溶性糖比例的60％以上，顯著高于紅肉枇杷，而葡萄糖含量則顯著低于后者。此外，白玉、白沙、冠玉和常綠四號(hào)等白肉枇杷果實(shí)可溶性糖組成也以蔗糖為主，占總可溶性糖含量的50％～65％，顯著高于夾腳洛陽青和大紅袍等紅肉枇杷果實(shí)，而葡萄糖含量表現(xiàn)為白肉枇杷低于紅肉枇杷果實(shí)的現(xiàn)象，在前者中．葡萄糖含量占總可溶性糖含量的8％～20％，而在后者則占30％～45％(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，均與本研究結(jié)果相一致。}

白肉枇杷和紅肉枇杷果實(shí)在糖組成方面存在的這種差異與蔗糖代謝相關(guān)酶活性有關(guān)。不同品種枇杷果實(shí)的轉(zhuǎn)化酶和SUS-cleavage活性均明顯高于SPS和SUS-synthetic活性，即成熟枇杷果實(shí)蔗糖代謝酶的凈活性均為負(fù)值，表明果實(shí)組織中的蔗糖趨于分解。Ding等報(bào)道枇杷果實(shí)采后20℃貯藏過程中蔗糖含量快速下降，認(rèn)為采后枇杷果實(shí)的蔗糖易水解。¹⁴C示蹤研究顯示，柑橘果實(shí)蔗糖含量從維管束到囊瓣壁再到汁囊的運(yùn)輸過程中不斷減少，作為光合產(chǎn)物進(jìn)入果實(shí)的蔗糖逐漸被消耗。紅肉枇杷果實(shí)較低的酶凈活性表明其蔗糖水解能力較強(qiáng)．這可能是導(dǎo)致該類型果實(shí)蔗糖相對(duì)含量較低的重要原因。蔗糖水解產(chǎn)物主要包括葡萄糖和果糖，同白肉枇杷果實(shí)相比，我們發(fā)現(xiàn)蔗糖水解能力較強(qiáng)的紅肉枇杷果實(shí)積累較多葡糖糖，作為蔗糖水解產(chǎn)物的葡萄糖可能是成熟紅肉枇杷果實(shí)的主要貯存形式，而白肉枇杷果實(shí)的糖貯存形式以蔗糖為主。枇杷果實(shí)采后貯藏10d，葡萄糖趨于增加，果糖維持穩(wěn)定，而蔗糖水平持續(xù)下降，該結(jié)果進(jìn)一步表明采后成熟枇杷果實(shí)的蔗糖趨于分解。枇杷果實(shí)己糖激酶(HXK)和果糖激酶(FRK)活性約分別為1400和1600um01.h^{-1·g-1，顯著高于蔗糖代謝酶活性，較高的果糖代謝酶可能影響果糖含量，進(jìn)而促使葡萄糖相對(duì)含量較高。}

果實(shí)糖組成是影響內(nèi)在品質(zhì)的重要因子。本試驗(yàn)表明，白肉枇杷果實(shí)具有較高的蔗糖含量．其相對(duì)含量是紅肉枇杷的2倍左右，蔗糖代謝相關(guān)酶的綜合作用是影響果實(shí)糖組成的重要因子，凈活性較高可能是促使白肉枇杷果實(shí)積累較多蔗糖的主要原因。研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了白肉枇杷和紅肉枇杷果實(shí)在品質(zhì)方面的異同，豐富了果實(shí)品質(zhì)生物學(xué)研究?jī)?nèi)容，也為開展果實(shí)品質(zhì)的遺傳改良提供了依據(jù)。