上頜骨內(nèi)置式持續(xù)等張縫牽引成骨機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的:通過對(duì)山羊顴上頜縫持續(xù)等張縫牽引成骨來延長(zhǎng)上頜骨復(fù)合體，探討縫牽引成骨的機(jī)制。方法:在山羊兩側(cè)顴上頜縫安置自主設(shè)計(jì)制作的內(nèi)置式微型自動(dòng)持續(xù)等張縫牽引器，縫兩側(cè)鈦釘標(biāo)記，術(shù)后定期拍攝X線片，并在4、6、8周切取牽引和未牽引的顴上頜縫及新生骨組織，進(jìn)行組織學(xué)觀察。采用免疫組化染色方法研究標(biāo)本中bFGF、TGF-β1、VEGF的表達(dá)和變化。結(jié)果:在牽引力的作用下，所有山羊上頜骨復(fù)合體均成功前徙。在牽引6周時(shí)出現(xiàn)軟骨細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)之間有新生骨小梁形成。間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞中bFGF、TGF-β1、VEGF均有不同程度的陽性表達(dá)或陽性表達(dá)增加，呈時(shí)間和空間上的變化。結(jié)論:經(jīng)縫牽引成骨的成骨機(jī)制以膜內(nèi)成骨為主，但也有軟骨成骨;bFGF、TGF-β1、VEGF以及3種膠原均參與了縫牽引成骨的成骨過程，促進(jìn)了間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的增殖、分化及新骨的改建。

[關(guān)鍵詞]縫牽引成骨;上頜骨復(fù)合體;軟骨成骨;膜內(nèi)成骨;生長(zhǎng)因子

[中圖分類號(hào)]Q813.1R782.2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455(2010)06-0852-05

Experimental studies of isotension continuous sutural distraction osteogenesis mechanism on maxillary complex

LI Yan，SHI Ze-hong，YIN Ning-bei， DU Ming-juan，F(xiàn)ANG Lin，SHI Bing-bing，ZHANG Lei，ZHAO Zhen-min

(The First Department of Plastic Surgery Hospital，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Science，Beijing 100144，China)

Abstract: ObjectiveTo study the mechanism of bone formation by observing the histology changes and bFGF、TGF-β1、VEGF expressions in zygomatico-maxillary suture and new bone tissue.MethodsUse goats as experimental animals， several self-designed internal nickel-titanium shape memory metal braces were placed on maxillary surface，by taking X-ray regularly after operation to show the exact distances that maxilla moved. Then the new bone and suture tissue were obtained in 4weeks，6weeks and 8weeks after distraction to observe the histology changes and collagen changes through microscope. The expressions ofbFGF、TGF-β1、VEGF were investigated by means of immunohistochemistry.ResultsAll goats' maxillary complex advanced successfully. Six weeks after distraction， the newborn cartilage cell group appears， and between the cartilage cell group there were forming new bone trabeculas. bFGF、TGF-β1、VEGF expressed in all groups and varies with distracting time.ConclusionsCartilaginous osteogenesis participate in bone formation in the sutural tissue. On the surface of the maxilla， main mechanism of bone formation is intramembranous osteogenesis，bFGF、TGF-β1、VEGF and all three types of collagen take part in the bone regeneration.

Key words:sutural distraction osteogenesis;maxillary complex;cartilaginous ossification;intramembranous ossification;growth factors

縫牽引成骨(Sutural distraction osteogenesis，SDO)是在截骨牽引(Distraction osteogenesis，DO)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種微創(chuàng)、療效確切的矯治顱面骨骼畸形的治療方法，對(duì)顳骨研究表明[1]其縫牽引成骨機(jī)制為膜內(nèi)成骨，而對(duì)于上頜骨復(fù)合體而言，其成骨方式有待進(jìn)一步探討。此外既往對(duì)截骨牽引研究發(fā)現(xiàn)[2-4]，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)在截骨牽引的新生骨組織中均有高水平表達(dá)，但是在縫牽引新生骨組織中這些因子以及膠原纖維的表達(dá)如何，目前國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。

本研究以山羊顴上頜縫牽引成骨模型為基礎(chǔ)，采集骨縫及新生骨組織標(biāo)本，探討縫牽引中縫及新生骨組織中的細(xì)胞及膠原的變化規(guī)律和bFGF、TGF-β1和VEGF在間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中表達(dá)規(guī)律，初步探討經(jīng)縫牽引成骨的成骨機(jī)制。

1材料和方法

1.1 材料:3～4月齡健康成年中國(guó)山羊4只，3只牽引組1只對(duì)照組，雌雄不限，平均體重5kg(協(xié)和整形外科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，速眠新、蘇醒靈(北京三有獸用麻藥公司)，內(nèi)置式微型自動(dòng)持續(xù)等張縫牽引器，鎳鈦記憶合金材料，每個(gè)縫牽引器在壓縮至18mm時(shí)可以產(chǎn)生1kg力量(與北京記憶公司合作研制)，bFGF抗體、TGF-β1抗體(Santa Cuze公司)，VEGF抗體(Zeta公司)，PV6001試劑盒(美國(guó)GBI)，天狼猩紅染液、甲苯胺藍(lán)染液(本實(shí)驗(yàn)室自配)，BX51倒置顯微鏡(Olympus公司)

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)操作:牽引組動(dòng)物術(shù)前禁水、禁食12h，速眠新肌注麻醉。面部去毛、碘伏消毒， 眶下緣L形切口進(jìn)入， 逐層切開至上頜骨， 顯露顴上頜縫，于顴上頜縫兩側(cè)用打孔鉆打6孔，每組2孔，橫跨顴上頜縫，各組平行，間距10mm，顴上頜縫上下2孔間距離為18mm，將微型自動(dòng)縫牽引器壓縮后安置于骨孔內(nèi)，每側(cè)安裝3個(gè)牽引器(每側(cè)共產(chǎn)生3kg力量作用于與顴上頜縫)，固定后于上頜縫兩側(cè)各植入鈦釘一枚為標(biāo)記，記錄鈦釘間距離，然后逐層縫合關(guān)閉切口。同法處理對(duì)側(cè)。術(shù)后1周內(nèi)肌注青霉素80萬U，2次/日。常規(guī)精飼料圈養(yǎng)，術(shù)后7天拆線，于術(shù)后即刻、術(shù)后1周及術(shù)后3周做X線片檢查以了解顴上頜縫擴(kuò)張情況(圖2)。

1.2.2標(biāo)本處理:牽引組組分別于術(shù)后4周、術(shù)后6周、術(shù)后8周全麻下切取顴上頜縫及其周圍骨性組織，對(duì)照組于術(shù)后4周取材，6%多聚甲醛液4℃固定24h、0.5mol 甲酸脫鈣，修整標(biāo)本，沿縫垂直向剖開，酒精逐級(jí)脫水，石蠟包埋，沿骨縫垂直向切取5μm 厚的連續(xù)切片，隨機(jī)抽取部分切片HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、天狼猩紅染色及免疫組織化學(xué)染色。1.2.3HE染色及特殊染色:蠟塊縱向切片(5μm) ， HE染色， 普通光鏡觀察縫及新骨組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)及再生修復(fù)情況。甲苯胺藍(lán)染色，觀察骨基質(zhì)及成骨細(xì)胞情況。同時(shí)縱向切片(5μm) ， 按文獻(xiàn)[5]方法行飽和苦味酸天狼星紅染色， 偏光顯微鏡觀察縫及新骨組織中的膠原變化。偏光顯微鏡下Ⅰ型膠原纖維緊密排列， 呈較強(qiáng)的雙折光性， 黃色或紅色;Ⅱ型膠原纖維顯示弱的雙折光， 呈多種彩的疏松網(wǎng)狀分布;Ⅲ型膠原纖維顯示弱的雙折光， 呈綠色的細(xì)纖維。觀察時(shí)需在正交下進(jìn)行。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色bFGF、TGF-β1、VEGF:石蠟縱向切片(5μm)，脫蠟至水，PBS浸泡2min×3次后高壓抗原修復(fù)，3%H2O2室溫孵育10～15min，蒸餾水沖洗PBS浸泡2min×3次，分別滴加一抗工作液:bFGF(1:150)、TGF-β1(1:250)、VEGF(1:60)，4℃過夜，PBS沖洗2min×3次，滴加適當(dāng)量PV6001，室溫孵育30min，PBS沖洗2min×3次，DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為這三種生長(zhǎng)因子的陽性信號(hào)。

2結(jié)果

2.1 大體觀察及X線片觀察見圖1、2。

2.2 組織學(xué)觀察

2.2.1 HE染色:見圖3。

2.2.2甲苯胺藍(lán)染色:見圖4

2.2.3偏振光顯微鏡觀察:見圖5。

2.3免疫組織化學(xué)染色:縫及新骨組織切片中bFGF、TGF-β1、VEGF免疫組化染色陽性信號(hào)的細(xì)胞定位與強(qiáng)度分級(jí)結(jié)果見表1。

bFGF在牽引過程中隨著牽引時(shí)間均有增強(qiáng)趨勢(shì)，間充質(zhì)細(xì)胞中4周時(shí)出現(xiàn)陽性表達(dá)，8周開始減弱，成骨細(xì)胞中8周才開始增強(qiáng)，骨細(xì)胞中4周即開始增強(qiáng)，8周后仍未減弱，TGF-β1在間充質(zhì)細(xì)胞中牽引后四周即開始強(qiáng)陽性表達(dá)，并一直維持到8周，成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中減弱為弱陽性表達(dá)，VEGF在間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞中牽引6周時(shí)表達(dá)為強(qiáng)陽性，骨細(xì)胞中VEGF在各組牽引過程中無變化，維持弱陽性表達(dá)。

3討論

縫牽引成骨通過牽張裝置對(duì)骨縫施加特定大小的機(jī)械應(yīng)力，激發(fā)骨組織自身生長(zhǎng)潛力，從而達(dá)到增加骨量的治療目的。在牽張力作用下，成骨速率可以達(dá)到兒童期骨自然生長(zhǎng)率的4～6倍[6]。因此縫牽引被視作一種新的內(nèi)源性組織工程(endogenous tissue engineering)技術(shù)。自從縫牽引成骨應(yīng)用于顱面骨骼畸形矯正以來，臨床上取得了顯著的療效，而縫牽引成骨由于其微創(chuàng)、無風(fēng)險(xiǎn)或風(fēng)險(xiǎn)小、作用范圍廣、能使整個(gè)上頜骨復(fù)合體得到延長(zhǎng)、顯著的矯正效果也越來越成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，為兒童唇腭裂術(shù)后繼發(fā)面中部發(fā)育不全的治療提供了一個(gè)很好的手術(shù)方法，但是其成骨機(jī)制目前仍不十分明了。

牽引成骨術(shù)的骨形成機(jī)制一直是爭(zhēng)議的焦點(diǎn)。Karp等[7]認(rèn)為，狗下頜骨的牽引成骨機(jī)制主要為膜內(nèi)骨化。Komuro等[8]證實(shí)，兔下頜骨新骨形成以膜內(nèi)骨化和軟骨內(nèi)骨化兩種方式同時(shí)進(jìn)行。Sawaki等[9]研究認(rèn)為，狗下頜骨牽引骨形成的主要形式為膜內(nèi)骨化，部分區(qū)域可見纖維性軟骨島。骨發(fā)育過程中，軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞是三種主要細(xì)胞，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的含量分別反映了軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的成熟狀況。膠原纖維，不僅起支架作用還影響著細(xì)胞的增殖與分化、骨質(zhì)的形成與吸收以及骨基質(zhì)礦化等， 機(jī)體通過膠原的合成分解和改建使骨修復(fù)得以完成和完善。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上頜骨縫牽引過程中，三種膠原都存在，其含量隨著牽引時(shí)間的延長(zhǎng)而變化，6周時(shí)在HE切片上可以清楚地發(fā)現(xiàn)縫組織有軟骨細(xì)胞團(tuán)形成，其間有新生骨小梁，Ⅰ型膠原增多，Ⅱ型膠原逐漸減少;在甲苯胺藍(lán)染色的切片上，牽引8周時(shí)，在骨膜下可以見到新骨形成，因此從本實(shí)驗(yàn)中可以推測(cè)，縫牽引中存在兩種成骨方式:軟骨成骨和膜內(nèi)成骨，以膜內(nèi)成骨為主，其中軟骨成骨參與了骨縫組織的新骨的形成，而在骨膜下，均為膜內(nèi)成骨，并且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原均參與了骨的形成和改建。

盡管縫牽引的成骨方式和骨改建過程與骨折修復(fù)有顯著不同，但同樣涉及一系列生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子乃至激素的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，其中骨生長(zhǎng)因子在牽張后新骨再生中的作用可能非常重要。bFGF是一種廣譜的有絲分裂原，主要由間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞合成，對(duì)來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的細(xì)胞具有明顯的促進(jìn)增殖作用，并促進(jìn)新生血管形成，加速軟組織、軟骨、骨組織及神經(jīng)組織損傷的修復(fù)。此外，它不僅能刺激成骨樣細(xì)胞表達(dá)TGF-β1，而且能誘導(dǎo)微血管生成，與其他骨和血管生成因子協(xié)同調(diào)控成骨活動(dòng)。Tavakoli等[10]用牽張成骨術(shù)延長(zhǎng)綿羊下頜骨后20天，發(fā)現(xiàn)bFGF呈穩(wěn)定高水平表達(dá)。Okazaki[11]等通過注入外源性bFGF于兔脛骨牽張間隙內(nèi)，發(fā)現(xiàn)bFGF有促進(jìn)新骨生成的效應(yīng)。TGF-β1廣泛存在于正常組織細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)間葉細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的增殖與分化，加速血管的生成，增加Ⅰ型膠原的合成，是骨吸收和骨形成之間有力的調(diào)節(jié)和偶聯(lián)因子，并可抑制新破骨細(xì)胞的形成。TGF-β1可以直接刺激成纖維細(xì)胞外基質(zhì)的合成，并對(duì)新形成的基質(zhì)降解有顯著的抑制作用，可刺激成骨細(xì)胞分泌幾種骨基質(zhì)蛋白，如纖維結(jié)合蛋白、蛋白聚糖和骨粘連素等[12-13]。此外它對(duì)其他激素及生長(zhǎng)因子有調(diào)控作用，其中對(duì)VEGF有促進(jìn)和抑制雙向調(diào)節(jié)作用[14-15]。VEGF通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，具有強(qiáng)大、特異性促血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和血管生成作用。其他因子的促血管生成作用全部或部分通過VEGF的作用得以實(shí)現(xiàn)。Spector等[16]發(fā)現(xiàn)VEGF對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞無增殖的作用，但能引起成骨細(xì)胞遷移分化。Tsurumi等[17]將培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞加入一定量的VEGF發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞對(duì)1，25-二羥維生素D3(1，25(OH)2D3)的合成作用明顯增強(qiáng)。由于1，25(OH)2D3是鈣合成所必需的，因此VEGF可能參與了成骨及骨塑形過程。金增強(qiáng)等[18]對(duì)犬進(jìn)行面中縫牽引發(fā)現(xiàn)，骨縫中出現(xiàn)大量新生血管，受張力影響的上頜骨周圍骨縫出現(xiàn)適應(yīng)性重建。血管生成可以為骨再生提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物運(yùn)輸，為局部骨再生及代謝提供有利的微環(huán)境。

本研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中，除在間充質(zhì)細(xì)胞中bFGF表達(dá)陰性外，其他因子在三種細(xì)胞中均有陽性或弱陽性表達(dá)，分析可能與我們所采用的動(dòng)物年齡較小，正處于快速生長(zhǎng)期有關(guān)。實(shí)驗(yàn)組山羊顴上頜縫及縫周新生骨組織中，除VEGF在骨細(xì)胞中表達(dá)不明顯外，三種因子在三種細(xì)胞中均有程度不同的表達(dá)，且隨著牽引時(shí)間變化而變化，牽引后4周在間充質(zhì)細(xì)胞中bFGF出現(xiàn)陽性表達(dá)，TGF-β1同時(shí)出現(xiàn)陽性表達(dá)增強(qiáng)，VEGF陽性表達(dá)稍滯后于bFGF和TGF-β1，6周后表達(dá)增強(qiáng)，分析可能在持續(xù)等張的牽引力的作用下，縫組織中間充質(zhì)細(xì)胞分泌bFGF增加，促進(jìn)了間充質(zhì)細(xì)胞的增殖與分化，同時(shí)bFGF水平的增高也促進(jìn)了TGF-β1的分泌，共同誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞的增殖與分化，在TGF-β1的誘導(dǎo)下，VEGF的分泌增加，發(fā)揮特異性促血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和血管生成作用，為局部骨再生、改建及代謝提供了有利的微環(huán)境。同時(shí)在VEGF的作用下，1，25(OH)2D3的合成作用明顯增強(qiáng)，局部鈣攝取增加，為新生骨的改建提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。在成骨細(xì)胞中bFGF于8周后陽性表達(dá)才開始增強(qiáng)，VEGF在6周即開始陽性表達(dá)，均滯后于間充質(zhì)細(xì)胞，在骨細(xì)胞中，bFGF 4周開始強(qiáng)陽性表達(dá)，TGF-β1和VEGF陽性表達(dá)無增強(qiáng)或減弱，在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，牽引8周后，TGF-β1及bFGF在間充質(zhì)細(xì)胞和骨細(xì)胞中仍維持高水平的表達(dá)，陽性表達(dá)維持時(shí)間較截骨牽引長(zhǎng)，且高水平表達(dá)出現(xiàn)時(shí)間也較截骨牽引晚，分析可能由于縫牽引沒有截骨，對(duì)縫作用比較溫和有關(guān)，其次由于采取了持續(xù)、等張的牽引力進(jìn)行牽引，在持續(xù)、等張的力的刺激下，由于力的持續(xù)作用，導(dǎo)致了分泌細(xì)胞持續(xù)分泌TGF-β1及bFGF等骨形成因子，維持細(xì)胞中這些因子的高表達(dá)，促進(jìn)骨再生與重建。其強(qiáng)陽性表達(dá)何時(shí)出現(xiàn)下降還需要進(jìn)一步加以研究。

綜上，通過本實(shí)驗(yàn)可證實(shí)，在縫牽引過程中，機(jī)械牽引力轉(zhuǎn)變?yōu)樯锓肿有盘?hào)，使骨縫組織細(xì)胞分泌bFGF、TGF-β1、VEGF等細(xì)胞因子，在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控下，骨縫間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、并向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞分化，通過膜內(nèi)成骨、軟骨內(nèi)成骨這兩種成骨方式形成新生骨組織。在成骨的過程中，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ三種類型的膠原均參與了成骨及改建過程，并隨著牽引過程不斷進(jìn)行，其含量發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。

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[收稿日期]2010-03-07 [修回日期]2010-04-25

編輯/張惠娟