p38MAPK及其信號通路在鼻息肉中的作用

【摘要】:目的:研究p38MAPK及其信號通路在鼻息肉發病中的作用機制，以便更加深入的闡明鼻息肉的發病機制，為臨床治療鼻息肉及尋找特異性治療藥物提供理論依據。方法:選取20例未采用糖皮質激素治療的復發性鼻息肉組織標本、20例初發鼻息肉組織標本、20例正常鼻黏膜組織。實驗分為三組:A組:復發性鼻息肉組;B組:初發性鼻息肉組;C組:正常下鼻甲黏膜組，每組各20例。處理因素:體內為布地奈德;體外為布地奈德、克拉霉素和p38MAPK特異性抑制劑SB203580。按1997海口標準進行臨床分期分型。上述標本部分于-70℃凍存備用，(1)采用HE染色和免疫組化染色對鼻息肉和正常鼻黏膜組織中的p38MAPK蛋白進行觀測并拍照，并用JD109或JD801圖像分析系統進行圖像分析，測定陽性細胞數密度和灰度值。(2)按常規Western-blot實驗操作步驟。結果判定:凝膠圖像分析系統對比p38MAPK與GAPDH灰度比值。實驗分體內和體外兩個階段。以P<0.05為差異有統計學意義。結果:p38MAPK在正常下鼻甲黏膜組織中無或極少量表達，在鼻息肉組織中均顯示高表達(P<0.01);復發型鼻息肉組織p38MAPK的陽性表達面積和密度均高于II型鼻息肉組(P<0.05)。結論:(1)p38MAPK在鼻息肉組織中高表達，而且在復發性鼻息肉組織中表達更顯著。(2)結果表明p38MAPK信號通路參與鼻息肉的發生發展。

【關鍵詞】:鼻息肉;p38MAPK;免疫組織化學

【中圖分類號】R765.9【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)06-052-2

鼻息肉是一種常見病，發病率及復發率均較高，目前治療最有效的方法為鼻內鏡手術加糖皮質激素治療，但是治療后仍有20%左右復發，是鼻科目前治療的難點。多種炎癥因子的表達和EOS的作用是鼻息肉發生的重要環節[1]。

隨著免疫學和分子生物學等學科的飛速發展，研究證明參與鼻息肉病理過程的化學介質多達數十種甚至上百種。其中細胞因子(cytokines)的作用倍受重視。細胞因子是由機體的免疫細胞和非免疫細胞合成和分泌，具有較強的生物活性，廣泛存在于鼻息肉的微環境中。目前認為鼻息肉主要是由多種細胞因子參與的一種持續性炎癥反應。p38MAPK信號通路是新近闡明的參與炎癥機制的信號通路之一，可能在鼻息肉中起至關重要的介導TNF-α與COX-2的信號傳導作用。

鼻息肉的發病機制中可能也存在經p38MAPK信號傳導通路信號的干預和調控。目前相關文獻中對p38MAPK信號傳導通路在鼻息肉中的作用研究很少。有研究發現，p38MAPK在鼻息肉組織中的黏膜上皮、腺上皮和血管的周圍出現異常表達，且核內有磷酸化p38MAPK的表達[2，3]。

1材料和方法

1.1標本的選取標本選取近1年我院耳鼻喉科住院和門診行鼻內鏡手術的復發性鼻息肉患者20例，所有患者均有兩次以上鼻息肉手術史，術前均未接受過糖皮質激素治療;初次鼻息肉患者20例，未進行過鼻腔鼻竇手術，亦未接受過糖皮質激素治療;行鼻腔淚囊吻合術或鼻中隔矯正術，取正常鼻黏膜組織20例。要求所有患者經檢查無變應性鼻炎、支氣管哮喘、慢性支氣管炎、阿司匹林耐受不良和其他系統嚴重疾患。并按1997海口標準進行臨床分期分型。研究前1個月內未進行激素和抗組胺藥物治療。經手術取出組織，術后均經病理證實。

1.2主要試劑(1)p38MAPK兔抗人多克隆抗體:購自美國Cayman公司，工作濃度1:250。(2)免疫組化二抗試劑盒SP-9001(生物素標記羊抗兔IgG):購自北京中杉金橋生物試劑公司。(3)DAB染色試劑盒:購自北京中杉金橋生物試劑公司。(4)多聚賴氨酸:購自武漢博士德公司。(5)牛血清白蛋白(BSA):SIGMA公司產品。

1.3方法(1)石蠟組織塊制作:手術切除的鼻息肉和下鼻甲粘膜組織立即切成1.5×1.5×1.5mm3的組織塊，并快速投入10%甲醛溶液固定液中，固定12小時。酒精脫水、二甲苯透明后浸蠟，包埋，待石蠟全部凝固后，推出蠟塊。(2)石蠟切片:修整蠟塊，調整控制切片厚度約5micro;m，切成薄片后，須粘在玻璃片上，以記號筆在玻片上編號，放入溫箱中烘干。(3)免疫組織化學檢測p38MAPK在鼻組織中的表達:將切片脫蠟入水。(4)抗原微波修復。(5)血清封閉抗原Fc段受體:取出玻片勿洗，直接加非免疫血清(二抗同族)，置于濕盒中，4℃，過夜。滴加一抗:傾去血清，勿洗，滴加一抗p38MAPK(1:250)50μl。陽性對照采用一肝癌組織標本同樣滴加一抗。陰性對照采用一鼻息肉石蠟切片，一抗用PBS替代。標本置于濕盒中，4℃，過夜。次日，用PBS洗3min，重復3次。加入辣根過氧化物酶標記二抗IgG，37℃，10～15min。用PBS洗3min，重復3次。加入辣根過氧化物酶標記試劑，37℃，10～15min，再用PBS洗3min，重復3次。加入DAB顯色液，室溫顯色5～10min，鏡下控制反應時間，適時終止顯色反應。單蒸水沖洗，蘇木素復染幾秒鐘(稀釋1:5，過濾)，沖洗，切片脫水，透明，中性樹膠封片。

光學顯微鏡下觀察鼻組織中p38MAPK陽性表達情況。6個高倍視野光鏡下觀察照像，然后用JD109圖像分析系統進行圖像分析，測定陽性細胞數密度和灰度值。

Western blot方法檢測磷酸化p38(p-p38)含量，各組分別切取50～100mg黏膜組織，盡量剪碎，按照北京普利萊公司胞漿胞核蛋白提取試劑盒的說明提取核蛋白。經蛋白定量，每條泳道加樣15μL行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS 2PAGE)分離蛋白質，經電轉印將蛋白質轉移到硝酸纖維素濾膜上。牛血清蛋白室溫封閉1h。加入稀釋度為1:200的兔抗p-p38多克隆抗體，4℃孵育20h。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，稀釋度為1:2000，室溫下孵育2h，經TBS洗滌，DAB顯色，分析各條帶磷酸p38(p-p38MAPK)和β-actin的灰度值，并相除來進行標準化，作為p38的相對活化水平。

1.4統計學分析

統計學分析應用SPSS12.0軟件分析系統，采用T檢驗分析組間顯著性差異，以P<0.05為具有統計學意義。

2結果

2.1p38MAPK免疫組化染色結果

免疫組織化學染色結果顯示，正常鼻黏膜組織中無或少量弱陽性染色;在鼻息肉組中可見大量p38MAPK的陽性染色，陽性染色呈棕黃色顆粒，主要集中在胞漿;在體外實驗經布地奈德和克拉霉素及和p38MAPK特異性抑制劑SB203580處理后，鼻息肉組中僅可見p38MAPK呈弱陽性染色。

2.2p-p38及β-actin凝膠電泳結果(見圖1)

為研究p38鼻息肉生成中的作用及機制，我們運用westernblot白印跡法定量技術比較了核p38蛋白(P-P38)在三種組織中的表達水平，結果示P-P38在鼻息肉組及對照組灰度的相對值分別為:0.767士0.77和0.355±0.087。二者相比有顯著性差異(P<0.05)(見表1);經布地奈德和克拉霉素及和p38MAPK特異性抑制劑SB203580處理后，P-P38在鼻息肉組灰度的相對值分別為:0.582士0.69。(見圖1)

表1 P-P38在鼻息肉和正常組織的表達(P-P38/β-action比值，x±s)

組別例數x±s

鼻息肉組 200.767±0.077

正常組150.355±0.087

圖1 P-P38及β-actin凝膠電泳圖

(A:為藥物干預前，P-P38表達為陽性;B:為藥物治療后，P-P38表達呈弱陽性。)

3討論

鼻息肉是一種常見病，發病率及復發率均較高，目前治療最有效的方法為鼻內鏡手術加糖皮質激素治療，但是治療后仍有20%左右復發，是鼻科目前治療的難點。鼻息肉的發病機制尚未完全明確。目前認為鼻息肉主要是由多種細胞因子參與的一種持續性炎癥反應。細胞因子是由機體的免疫細胞和非免疫細胞所合成和分泌，具有較強的生物活性，廣泛存在于鼻息肉的微環境中。p38MAPK信號通路是新近闡明的參與炎癥機制的信號通路之一，可能在鼻息肉中起至關重要的介導TNF-α與COX-2的信號傳導作用。

p38蛋白是新近發現的與炎癥、應激反應密切相關的蛋白激酶，激活后的p38即由胞漿進入到細胞核，表現為其活性形式磷酸化p38(p-p38)，它是細胞內主要的信號轉導系統[2]。p38MAPK(Mitogen-activated proteinkinase，MAPK)信號傳導通路是新近闡明的一條MAPK通路，p38MAPK被激活后，引起下游相應的信號啟動并產生廣泛的病理生理效應，通過“級聯”程序調控細胞因子和應激引起的細胞反應來快速實現信號傳遞，造成炎癥反應“級聯放大”[3]。許多研究表明，p38信號傳導通路在炎性反應性疾病的發生和發展中具有調控作用。研究發現，在哮喘、慢性阻塞性肺病、變應性鼻炎及慢性鼻-鼻竇炎中，p38MAPK的活化與各種細胞因子、炎性介質的釋放有關[4]。Boehme等研究證實，p38MAPK通路能夠被促炎因子TNF-ɑ所激活，TNF-α可快速誘導嗜酸性粒細胞中的p38MAPK的磷酸化，并呈時間、劑量依賴關系。鼻息肉的黏膜病理生理學改變與哮喘、變應性鼻炎及慢性鼻-鼻竇炎同屬于呼吸道黏膜炎癥反應，且密切相關。據此推測，鼻息肉的發病機制中可能也存在經p38M

APK信號傳導通路信號的干預和調控。目前相關文獻中對p38MAPK信號傳導通路在鼻息肉中的作用研究很少。有研究發現，p38MAPK在鼻息肉組織中的黏膜上皮、腺上皮和血管的周圍出現異常表達，且核內有磷酸化p38MAPK的表達[2，3]。

本課題研究結果顯示，p38MAPK在鼻息肉組織中高表達，而且在復發性鼻息肉組織中表達更顯著。表明p38MAPK信號通路參與鼻息肉的發生發展

參考文獻

[1] 米淑娜，李志明.鼻息肉相關致病因素研究的新進展[J].醫學綜述，2007，13(5):365-367.

[2] 亢麗芳，夏立軍.p38在慢性鼻-鼻竇炎和鼻息肉中的表達及意義[J].山東大學耳鼻喉眼學報，2008，22(6):517-519.

[3] 王相成，李玲香.p38MAPK信號通路關鍵靶點基因及腫瘤壞死因子在鼻息肉組織中的表達與意義[J].中國中西醫結合耳鼻咽喉科雜志，2008，(3):161-165.

[4] 黃翠萍，張珍祥，徐永健.哮喘大鼠肺組織p38蛋白激酶表達的變化及地塞米松對其影響[J].中華微生物學和免疫學雜志，2003，23(5):334-334.