中醫抗老駐顏古方抗小鼠光老化損傷的初步研究

[摘要]目的:初步研究中醫古醫籍記載的美容駐顏抗衰古方可能的抗光老化作用。方法:采用UVA/320～400nm+UVB/280～320nm紫外燈模擬日光紫外線組合造模光老化小鼠，選擇中藥古醫籍記載的美容駐顏抗衰古方每天分別灌胃各組小鼠，共12周。生化法檢測小鼠受試區皮膚組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH2Px)活性和丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(HYP) 含量。結果:接受實驗選擇的古醫籍記載的美容駐顏抗衰古方治療的小鼠，表現出不同程度的光保護效果。各組與UV損傷組比較:滋陰為主的神仙駐顏方GSH-Px、HYP表達有極顯著性差異(P<0.01)，SOD表達有顯著性差異(P<0.05);以補氣為主的黃芪六一散SOD、GSH-Px的表達有極顯著性差異(P<0.01)，MDA表達有顯著性差異(P<0.05);氣陰雙補生脈散SOD、GSH-Px、MDA、HYP的表達均有極顯著性差異(P<0.01);氣血雙補延齡固本丸SOD、GSH-Px的表達有極顯著性差異(P<0.01)，MDA、HYP的表達有顯著性差異(P<0.05);陰陽雙補、益腎填精的龜齡集方SOD、HYP的表達有極顯著性差異(P<0.01)，GSH-Px、MDA的表達有顯著性差異(P<0.05)。結論:實驗選擇的中藥古醫籍記載的美容駐顏抗衰古方有一定的抗光老化作用，有進一步研究運用的價值。

[關鍵詞]光老化;中醫古方;抗衰老;實驗研究;小鼠

[中圖分類號]R289.3 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)04-0578-03

Experimental study on the anti-senility effects of several Traditional Ancient Decoctions in mice ageing induced by photoage

LIU Yuan1， ZHANG Mi-na2 ，WEI Kai-feng2 ，LU Yuan3，LAI Ming-sheg3，LU Ping-cheng2

(1.Shenzhen City Fourth People's Hospital， Shenzhen 518033， Guangdong， China;2.Nanjing University of Traditional Chinese Medicine， Nanjing 210029， Jiangsu，China;3.Shenzhen City sixth People's Hospital，Shenzhen 518052， Guangdong，China)

Abstract:Objective To investigate the anti-senility effects of several classic doctions mentioned in books of Traditional Chinese Medicine (TCM) to senility induced by photoaging.MethodsA mice model exposed under UVA/320～400nm+UVB/280～320nm UV light to simulate sunlight ultraviolet was served. Mice were feed with several chosen traditional ancient decoctions which were said to have the effects of anti-senility.The experimental procedure lasted for twelve weeks. The levels of superoxide dismutase(SOD)， glutathiane peroxidase (GSH-Px)， malondialdehyde (MDA) and hydroxyproline(HYP)in the observed skin area of mice before and after experiment were assayed by biochemic methods. Results Mice received treatment of TCM decoctions showed different good effects of anti-photoage. Compared with UV group， Shenxianzhuyan Decoction which mainly menifested enhancing \"yin\"showed higher levels of GSH-Px and Hyp (P<0.01)， the difference of SOD was also sigficant (P<0.05). Huangqiliuyi Decoction which mainly menifested enhancing \"qi\" showed markedly sigficance in SOD、GSH-Px(P<0.01)，MDA level was also lower than that in UV group(P<0.05); Shenmai Decoction which had the effect of strengthen both \"qi\"and\"yin\"showed higher levels in SOD，GSH-Px，MDA and Hyp (P<0.01); Yanlingguben Decoction which had the effect of strengthen both \"qi\"andblood showed higher levels in SOD，GSH-Px (P<0.01); the levels of MDA and Hyp were also significant (P<0.05); Guilingji Decoction which strengthed both \"yin\"and \"yang\"and tonified the kidney and strengthened energy showed higher levels of SOD and Hyp (P<0.01)， the differences of GSH-Px，MDA when compared with UV were also sigficant (P<0.05).ConclusionThe present experiment revealed the effects of several chosen classic Chinese traditional decoctions of anti-photoage that deserves futher research work.

Key words:photoaging; anti-senility; Traditional Chinese Medicine (TCM); experiment; mice

紫外線(ultraviolet， UV)慢性損傷導致的皮膚光老化(photoaging)是皮膚提早衰老的重要因素，如何防治光老化已引起美容醫學界越來越多的重視。而研究植物草藥預防皮膚衰老一直是國內外美容醫學界被廣泛關注和經常使用的手段，并隨著研究的深入和有效的運用，已得到了眾多學者們的認同[1-2]。我國運用草藥美容駐顏有數千年歷史，歷代的本草醫藥著作中收錄記載了大量有效美容駐顏的植物，尤其是具有中醫醫學背景，獨特的復方中藥。大量研究顯示許多中藥單體和復方中藥具有良好的提高機體抗氧化、清除自由基的作用，有很好的抗衰老功效，但是否能有效預防或治療皮膚光老化?有關的研究尚不多。本研究選擇古醫籍記載的美容駐顏抗衰古方為對象，研究其可能的抗UV氧化損傷和抗光老化作用。

1材料和方法

1.1材料:神仙駐顏延年方(太平圣惠方):熟地黃、干地黃、甘菊花、天門冬;黃芪六一散(局方):炙黃芪、炙甘草、大棗 ;生脈散\\生脈飲(內外傷辨惑論):人參、五味子、麥冬;延齡固本丸(景岳全書):肉桂、澤瀉、茯苓、白術、黃芪、枸杞子、當歸、遠志、蓮須、山茱萸、酸棗仁;龜齡集(集驗良方):鹿茸、人參、熟地黃、海馬、杜仲、肉蓯蓉、補骨脂、兔絲子、枸機子、麻雀腦、丁香、淫羊藿、大青葉、沙仁、天冬。各方劑嚴格按照古醫籍記載的方劑配伍、劑量和制劑方法，由南京中醫藥大學藥理研究室制成成藥。

實驗動物采用清潔的昆明種小白鼠70只，體重20～25g，雌雄不限。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase ，CAT)、谷胱甘肽氧化酶( (glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(malondiald ehyde ，MDA)試劑盒(南京建成生物工程有限公司)，羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)標準品(中國科學院上海生物化學研究所)。SS-04P型光療儀(上海Sigma公司)，UVA紫外瑩光燈管/320～400nm、UVB紫外瑩光燈管/280～320nm(Philips公司)，UVA和UVB型紫外線輻照計(北京師范大學光電儀器廠)，DS-1型高速組織勻漿機(上海驃馬)，835型氨基酸自動分析儀(日本日立)。

1.2方法

1.2.1 動物分組和處理:小鼠實驗前適應環境1周，室溫控制在22℃～25℃，全價顆粒飼料喂養。隨機分組為神仙駐顏延年方組、黃芪六一散組、生脈散組、延齡固本丸組、龜齡集組，其余再列空白對照組及UV損傷對照組。各中藥組和空白對照組，UV損傷組每組10只。各組小鼠背部剃毛，面積3cm×2cm，以后在每次紫外線照射前重復剃毛;各中藥組小鼠中藥服藥量以古方推薦的服用量為標準，按李儀奎[3]加大給藥量公式換算出小鼠中藥飼喂量，每天2次用等量的生理鹽水灌胃飼藥;空白對照組和UV損傷對照組給予等量生理鹽水每天2次灌胃，直至實驗結束。

1.2.2小鼠模擬紫外線光老化皮膚損傷照射:除空白對照組，各組小鼠于首次灌胃后的第2周起開始實施紫外線照射。照射時將小鼠用固定器固定，頭部區遮光，置于SS-04P型光療儀下照射，光療儀紫外燈管以UVA/320～400nm+UVB/280～320nm模擬日光組合配置。UVB和UVA紫外線輻照計監控輻照強度，UVA輻照強度1.12mW/cm2， UVB輻照強度0.118mW/cm2。輻照時間以小鼠開始出現皮膚輕度泛紅為準，并按因試驗進度小鼠增強的耐受適應性統一作漸進性增時調整。每天照射一次，連續12周，累計照射劑量約為UVA198J/cm2、UVB 2.13J/cm2。

1.2.3抗氧化酶活性及MDA、HYP含量測定:最后一次紫外線照射后24h，處死小鼠，剪取各試驗組小鼠背部脫毛區皮膚，冷生理鹽水漂洗，除去皮下組織，再用6mm皮膚活檢鉆孔器，在處理好的脫毛區皮膚相對應位置鉆取8片相等面積的皮膚組織。濾紙拭干，按試驗組別稱重，剪成肉糜狀，放入勻漿器，加入9倍重量冷生理鹽水，制成10%組織勻漿。經4℃，8000 r/min 離心15min，取上清液，分別測定SOD、GSH-Px活性和MDA、HYP含量。操作方法組遵循試劑盒說明。

1.3數據統計處理:采用SPSS 15.0 統計軟件包，統計方法選用ANOVA分析，結果以 x±s表示，P<0.05為有顯著差異。

2結果

結果顯示實驗選擇的古醫籍記載的美容駐顏抗衰古方，表現出不同程度的抗御UV對小鼠皮膚的光老化損傷。各組與UV損傷組比較:滋陰為主的神仙住顏方GSH-Px、HYP表達有極顯著性差異(P<0.01)，SOD表達有顯著性差異(P<0.05);以補氣為主的黃芪六一散SOD、GSH-Px的表達有極顯著性差異(P<0.01)，MDA表達有顯著性差異(P<0.05);氣陰雙補生脈散SOD、GSH-Px、MDA、HYP的表達均有極顯著性差異(P<0.01);氣血雙補延齡固本丸SOD、GSH-Px的表達有極顯著性差異(P<0.01)，MDA、Hyp的表達有顯著性差異(P<0.05);陰陽雙補、益腎填精的龜齡集方SOD、Hyp的表達有極顯著性差異(P<0.01)，GSH-Px、MDA的表達有顯著性差異(P<0.05)，見表1。

3 討論

一定時量累積的UV輻射損傷會導致皮膚光老化，而UV輻射皮膚誘生的高濃度活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)則是光老化發生發展的重要介導。UV 可通過直接和間接的多種途徑使皮膚中ROS 濃度異常升高，高濃度的ROS 具有活潑的化學性質，可與皮膚組分發生復雜的化學反應產生多種生物學效應。消耗皮膚中的抗氧化系統包括抗氧化酶和低分子抗氧化劑，使脂質、蛋白質氧化，脂質過氧化物堆積，DNA 破壞，細胞損傷，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)高表達，膠原代謝障礙等，使皮膚產生一系列變化，導致皮膚光老化的發生[4]。

正常皮膚具有較完善的抗氧化防御系統，能清除ROS、抗御其損害，這一系統主要由谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px) 和谷胱甘肽(GSH) 、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT) 、血紅素氧化酶和醌氧化酶、鐵蛋白、金屬硫蛋白和硫氧還原蛋白(Trx) 以及低分子抗氧化劑維生素C 和維生素E 等組成。光老化使皮膚抗氧化系統產生復雜的適應性改變，使皮膚細胞抗氧化酶活性降低[5]。ROS引起的脂質過氧化反應可生成多種終產物，丙二醛(MDA)是其中最常見的一種，光老化皮膚中MDA 含量顯著升高。皮膚基質膠原受損是光老化特征性臨床外觀和組織病理表現的原因。光老化皮膚中正常膠原成分顯著減少，這主要是由于UV可通過多種途徑誘導基質金屬蛋白酶(MMPs)的表達，加速膠原降解，而且還能通過影響成纖維細胞數量和活性而使膠原合成減少[6-7]。另外，過氧化脂質或其氧化釋放產物如丙二醛(MDA)等能與膠原蛋白產生交聯，加速膠原蛋白的老化。羥脯氨酸(HYP)是膠原蛋白中一種相對特有、含量穩定(占13.4%)的氨基酸，其含量變化可反映膠原的代謝狀況。

大量中藥抗皮膚衰老的研究顯示，許多中藥含有各種氨基酸、脂類、多糖、有機酸、生物堿、皂苷、果膠、維生素、微量元素等多種成分，具有清除體內自由基，增強機體抗氧化能力，提高皮膚膠原纖維及膠原蛋白含量，改善皮膚微循環，提高調節免疫功能等作用[8]。而近來一些不多的有關中藥抗光老化研究發現人參、黃芪、黃芩、黃精、綠茶、芍藥、地榆、莪術、雷公藤等中藥及其提取物在改善皮膚組織結構、提高抗氧化酶活性、抑制基質金屬蛋白酶高表達、增強皮膚免疫防御功能等多方面對皮膚光老化起著防治作用。而認為中藥是拮抗皮膚光老化的一種有效手段，在改善和防治皮膚光老化方面具有巨大的潛力。在皮膚美容醫學方面具有重要的研究意義[9]。

我們的初步研究顯示，所選擇的古醫籍記載的美容駐顏抗衰延年古方均不同程度表現出一定的抗御UV對皮膚的光老化損傷作用:①能提高皮膚抗氧化酶活性;②抑制ROS誘導的脂質過氧化反應;③提高或維持皮膚膠原蛋白含量。雖然我們還不知道這些中藥古方的抗光老化的作用機理，也不清楚養陰、益氣、補血、滋腎填精不同作用偏向的古方在影響光老化時在不同的環節或有的差異，但我們認為這些中藥復方體現了中國傳統醫學的精髓和價值，能因人因證施宜，按機體氣血陰陽偏勝整體調治，預防光老化，抗御衰老。對它們的深入研究或會更有助于我們從中醫的認知角度來認識光老化，有助于開發出更有效和方便日常使用的抗光老化中醫藥產品。

[參考文獻]

[1]Afaq F，Mukhtar H.Botanical antioxidants in the prevention of photocarcinogenesis and photoaging[J].Exp Dermatol，2006，15(9):678-684.

[2]李 勤，劉宏偉，程 飚.草藥與皮膚衰老[J].中國美容醫學，2008，17(1):138-141.

[3]李儀奎.中藥藥理實驗方法學[M].2版.上海:上海科學技術出版社，2006:562.

[4]Rabe JH，Mamelak AJ，McElgunn PJ，et al.Photoaging: mechanisms and repair[J].J Am Acad Dermatol，2006，55(1):1-19.

[5]楊斌，郝飛.皮膚光老化、活性氧簇與抗氧化劑[J].中國美容醫學，2005，14(5):637-639.

[6]Quan T，Qin Z，Xia W，et al.Matrix-degrading metalloproteinases in photoaging[J].J Investig Dermatol Symp Proc，2009，14(1):20-24.

[7]Quan T，He T，Shao Y.Elevated cysteine-rich 61 mediates aberrant collagen homeostasis in chronologically aged and photoaged human skin[J].Am J Pathol，2006，169(2):482-490.

[8]王 倩.中藥延緩皮膚衰老的研究現狀[J].中國美容醫學，2006，l5(2):219-221.

[9]陳紹斐，馬麗俐.中藥對皮膚光老化防治作用的研究進展[J].中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2008，7(1):57-60.

[收稿日期]2010-01-04 [修回日期]2010-03-16

編輯/李陽利