聚羥基丁酸酯可吸收縫線生物相容性的實(shí)驗(yàn)室研究

[摘要]目的:研究聚羥基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate，PHB)可吸收縫線的生物相容性。方法:①將成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，傳代后與PHB可吸收縫線復(fù)合培養(yǎng)，設(shè)與經(jīng)聚氰基丙烯酸酯處理過的PHB可吸收縫線復(fù)合培養(yǎng)為對照組，觀察細(xì)胞生長情況;②行掃描電鏡檢查觀察細(xì)胞在絲線上的生長情況;③以MTT法檢測復(fù)合培養(yǎng)后的細(xì)胞活性。結(jié)果:①實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長良好，對照組細(xì)胞漂浮，收縮成團(tuán);②掃描電鏡下見細(xì)胞在絲線上貼附生長良好;③MTT法檢測實(shí)驗(yàn)組對細(xì)胞增殖無明顯影響。結(jié)論:PHB可吸收縫線具有良好的生物相容性。

[關(guān)鍵詞]可吸收縫線; 聚羥基丁酸酯;成纖維細(xì)胞

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號]1008-6455(2010)04-0531-03

Investigation of the biocompatibility of polyhydroxybutyrate absorbable suturein laboratory

WU Jin-hua1，LIU Bin1，AI Yu-feng2，YANG Qing-fang3，DONG Zhao-lin4

(1.Department of Burn and Plastic， Xi'an Central Hospital，Xi'an 710003，Shaanxi，China; 2.Sichuan Huamei Zixin Medical Cosmetology Hospital; 3.Polymer materials，Northwestern Polytechnical University University; 4.College of Life Science， Northwest University)

Abstract:ObjectiveTo investigate the biocompatibility of absorbable suture made of Polyhydroxybutyrate (PHB).MethodsThe fibroblast were co-cultured with PHB suture verse fibroblast co-cultured with PHB suture which had been dipped in the cyanoacrylate sdhesive(for cytotoxicity)，the proliferation and the adhering conditionare observed by inverted microscope and scanning electronic microscope，Culture fibroblast inculture plates containing PHB suture，investigate the attachment rate with MTT assay.ResultsThe number of fibroblastincreased co-cultured with PHB，and the comparison cellswere floated and shrinked，by scanning electronic microscope，there were cellsconnect each other adhering on the surface ofthe suture.ConclusionPHB have fine biocompatibility with fibroblast.

Key words: absorb suture;polyhydroxybutyrate;fibroblast

1 材料和方法

1.1 試件:實(shí)驗(yàn)所用PHB可吸收縫線為西北大學(xué)生命科學(xué)院和西北工業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系聯(lián)合研制，分子量為1.5×105～2.0×105，純度99%，菌種為園褐固氮菌G-3，纖維纖度0.04～0.18dtex。

1.2 儀器:BB16型CO2培養(yǎng)箱 (Heraeus，上海)，SW-CJ-1B型超凈工作臺(tái)( 蘇凈集團(tuán))，倒置顯微鏡(Olympus，Japan)，低溫冰箱( SANYO)，0.22μm、0.45μm微孔濾膜(Sigma)，S-520掃描電鏡(HITACHI，Japan)， DG5031型酶聯(lián)免疫檢測儀，LG10-3A低溫高速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.3 試劑:小牛血清(FBS杭州四季青生物有限公司)，DMEM培養(yǎng)液 (GIBCO公司)，胰蛋白酶 (Sigma)，MTT(Sigma)，bFGF ( Sigma)。

1.4 方法

1.4.1成纖維細(xì)胞的培養(yǎng):采取組織塊貼壁法進(jìn)行成纖維細(xì)胞培養(yǎng)。原代培養(yǎng):在手術(shù)室無菌條件下將手術(shù)切下的瘢痕組織小心去除表皮及皮下脂肪組織，生理鹽水反復(fù)沖洗，在超凈工作臺(tái)上用眼科剪刀將組織剪成大小約 1～2mm3的小塊，加入少量小牛血清，接種于40ml培養(yǎng)方瓶中，組織塊間留約0.3～0.5cm的間距，在95%空氣，， 5%CO2，37℃，飽和濕度條件下培養(yǎng)24h，使組織塊牢固貼附于瓶壁。 然后加入適量含20%小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，一周后取出培養(yǎng)瓶，棄去瓶內(nèi)培養(yǎng)液，Hank's液漂洗兩次后加相同的培養(yǎng)液5ml繼續(xù)培養(yǎng)。以后待細(xì)胞萌出后，同樣方法每周換液兩次。傳代培養(yǎng):待細(xì)胞生長基本融合成片時(shí)即可傳代，吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，Hank's液漂洗兩次，向瓶內(nèi)加入0.5%的胰蛋白酶溶液少許以覆蓋瓶底為度。大約1min左右，鏡下觀察細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大時(shí)立即吸出胰蛋白酶液，加入DMEM培養(yǎng)液終止消化。用吸管吸取培養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞使之脫落形成細(xì)胞懸液，按1:3比例分裝傳代，加入足量的DMEM培養(yǎng)液后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每周換液兩次，待細(xì)胞融合成單層再次傳代。

1.4.2 PHB可吸收縫線的制備:PHB可吸收縫線由西北工業(yè)大學(xué)用干法紡絲制得，其工藝參數(shù)為:紡絲溫度:噴絲管溫度為15℃～25℃;熱空氣溫度為50℃～60℃;擠出速度: 0.04 ml/min;繞卷速度: 43.2m/min。拉伸溫度:100℃;拉伸倍數(shù):4～6倍;熱定型溫度:80℃;熱定型時(shí)間:20～30min。

1.4.3 成纖維細(xì)胞和PHB可吸收縫線的復(fù)合培養(yǎng)

1.4.3.1 分組:①實(shí)驗(yàn)組:將PHB可吸收縫線剪成2cm長的線段，75%酒精浸泡消毒1h，撈出晾干后備用[1];②對照組:將PHB可吸收縫線剪成2cm長的線段，先浸于75%酒精消毒1h，再浸于聚氰基丙烯酸酯(細(xì)胞毒性物質(zhì))溶液中[2]，持續(xù)1h，撈出晾干后備用;③空白組:僅作單純細(xì)胞培養(yǎng)。

1.4.3.2 方法:取生長良好的第3～4代成纖維細(xì)胞，胰酶消化、離心，調(diào)整細(xì)胞密度為4×107，接種于各組培養(yǎng)瓶中，實(shí)驗(yàn)組5瓶，對照組5瓶，空白對照組5瓶，細(xì)胞生長至接近鋪滿時(shí)終止培養(yǎng)，倒置顯微鏡下照相。

1.5 MTT法檢測成纖維細(xì)胞在PHB材料上的粘附率及成活、增殖能力

1.5.1分組:①A組:bFGF+PHB可吸收縫線+成纖維細(xì)胞;②B組:PHB可吸收縫線+成纖維細(xì)胞;③C組:成纖維細(xì)胞。

1.5.2方法:取4塊96孔板，將PHB可吸收縫線剪成約2mm長的線段，按照分組置于A組和B組孔中，取第3代成纖維細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/ml，接種100μl于各孔中，每組復(fù)種10孔。分別于第1天、第3天、第5天、第7天各取1板，用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，具體方法:先吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，重新沿側(cè)壁緩緩加入DMEM(含10%FBS)200μl，然后再加入MTT(5mg/ml)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后吸出孔內(nèi)液體，每孔加入150μlDMSO，震蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長檢測各孔OD值。

1.5.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:各項(xiàng)均數(shù)以x±s表示，應(yīng)用spass 10.0軟件進(jìn)行方差分析及相關(guān)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1成纖維細(xì)胞與PHB復(fù)合培養(yǎng)

2.1.1 倒置顯微鏡觀察:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長良好，未見異常核分裂。PHB縫線周圍的成纖維樣細(xì)胞密集排列，生長良好(圖1)，對照組細(xì)胞漂浮，卷曲皺縮(圖2)，空白組細(xì)胞生長良好(圖3)。

2.1.2 掃描電鏡觀察:成纖維細(xì)胞復(fù)合PHB可吸收縫線:可見一些連接呈網(wǎng)狀的成纖維細(xì)胞附于PHB邊緣(圖4)。

2.2 MTT法檢測成纖維細(xì)胞在PHB材料上的粘附率及成活、增殖能力見表1。

3討論

3.1 醫(yī)用可吸收縫線是一種用于組織結(jié)扎、組織固定及傷口閉合的縫線，理想的手術(shù)縫線應(yīng)具備:①在創(chuàng)面的愈合過程中能夠維持足夠的強(qiáng)度;②創(chuàng)口愈合后可自行降解吸收;③不產(chǎn)生炎癥反應(yīng);④無刺激性及致癌性;⑤易于染色、打結(jié)、滅菌等。隨著科學(xué)的進(jìn)步及外科手術(shù)的發(fā)展，縫線的研究已成為研究的熱點(diǎn)，目前，美國ETHICON公司已提供出一整套完整的可吸收縫線，而我國自己能夠在醫(yī)院廣泛應(yīng)用的可吸收縫線只有羊腸線一種，其生產(chǎn)工藝落后，對人體組織刺激反應(yīng)大，吸收差[3-4]。為了適應(yīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的需要，本課題組合作研究開發(fā)出了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生物可降解材料---聚羥基烷酸(PHB)，在成功的將其作為組織工程的支架材料，應(yīng)用于體外構(gòu)筑組織工程血管，骨缺損修復(fù)、隆鼻材料等之后，現(xiàn)在又著力于PHB可吸收縫線的研究，本實(shí)驗(yàn)則對PHB可吸收縫線的生物相容性進(jìn)行初步研究，從而為下一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)，以期生產(chǎn)出我們自己的可吸收縫線。

3.2 PHB的特性及生物相容性評價(jià):為了獲得具有更高的強(qiáng)度和更高柔韌性，又有留存斷裂強(qiáng)度高、組織反應(yīng)小和吸收性能好的縫合線，人們對聚酯類生物降解材料紡絲制得的縫合線的研究較為廣泛[5]。PHB是原核微生物在營養(yǎng)失衡的情況下儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)的一種高分子聚合物，結(jié)構(gòu)與性能不同于淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、甲殼素等天然高分子，而更類似于化學(xué)合成的聚乙醇酸、聚乳酸聚已內(nèi)酯等脂肪族聚酯，脂肪族聚酯的機(jī)械強(qiáng)度好，但在降解過程中開會(huì)產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)[6]，而PHB因?yàn)橛缮锖铣桑杂泻芎玫慕M織相容性，且完全不含化工原料合成可能產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，降解產(chǎn)物β-羥基丁酸為人體血液固有成分，并可最終經(jīng)酮酵解為CO2和H2O排出體外。是極潔凈的生物塑料[7-8]。

湯蘇陽、艾玉峰[9]等將PHB浸提液作為條件培養(yǎng)液體外培養(yǎng)L929小鼠成纖維細(xì)胞評價(jià)PHB的生物相容性，并將浸提液通過靜脈注入大鼠體內(nèi)及直接將材料埋植于大鼠皮下以觀察其急慢性毒性反應(yīng)。結(jié)果顯示，PHB的細(xì)胞毒性為0級，組織相容性良好;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其無毒，局部及全身組織學(xué)未見病理學(xué)改變。本實(shí)驗(yàn)將PHB與成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞可在PHB周圍正常生長，保持其細(xì)胞形態(tài)，顯示出良好的生物相容性。

3.3 MTT比色法[10](四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法):此方法是由Mosroam在1983年提出，最初應(yīng)用于免疫學(xué)領(lǐng)域，后將該法應(yīng)用于生物材料的細(xì)胞毒性評價(jià)，該方法的原理是在被檢細(xì)胞中加入MTT后，活細(xì)胞的線粒體脫氫酶可將MTT還原并產(chǎn)生紫色結(jié)晶物，由于結(jié)晶物形成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，通過光比色測定OD值可間接反映細(xì)胞生長及增殖活性，此方法簡便、快速、靈敏，且結(jié)果穩(wěn)定可靠[11]。

[參考文獻(xiàn)]

[1]秦廷武，楊志明，張姝江，等.不同滅菌法對組織工程支架降解性和力學(xué)特性的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與健康雜志，2002，24(12):747-748.

[2]Jaonne HI，Sotirios K，Graeme H，et al. The use of ultrasonication to aid recellulation of acellular natural tissue scaffolds for use in anterior cruciate ligament reconstruction[J].Tissue Engineering，2007，13(7):1561-1572.

[3]陳希哲，斯方杰.可吸收手術(shù)縫線研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)·創(chuàng)傷與外科基本問題，1995，16(4):204-206.

[4]郭振友，溫永堂，傅振剛，等.醫(yī)用可吸收生物材料縫合線的研究[J].中國紡織大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，25(2):91-93.

[5]Jung NI，Jeong KK，Hyun KK，et al.In vitro and in vivo degradation behaviors of synthetic absorbable bicomponent monotilament suture prepare with Poly(p-dixanone) and its copolymer[J].Polym Degrad and Stab， 2007，92:667-674.

[6]Kathleen C，Anne G，Lisa S，et al. Polyglycolic acid-induced inflammation:Role of hydrolysis and resulting complement activation[J]. Tissue Engineering，2006，12(2)，301-308.

[7]易誠青，張明貴，曹云，等.骨髓基質(zhì)細(xì)胞與交聯(lián)明膠-聚羥基丁酸酯的生物相容性研究[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2006，15(3):262-265.

[8]Reusch GN， Sparrow AW， Gardiner J. Transport of poly-β-hydro ybutyrate in human plasma[J]. Biochem Biophysics Acta，1992，1123:33-40.

[9]]湯蘇陽，艾玉峰，董兆麟，等. 新型生物可降解材料PHB生物相容性研究[J]. 中國美容醫(yī)學(xué)， 2000，9(2): 86-88.

[10]司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].西安:世界圖書出版公司，1996:185-187.

[11]楊曉芳，奚廷斐.生物材料生物相容性評價(jià)研究進(jìn)展[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2001，18(1):123-128.

[收稿日期]2009-10-27 [修回日期]2010-03-10

編輯/張惠娟