rhBMP-2HACo復合材料異位誘導成骨中堿性磷酸酶活性的檢測

[摘要]目的:確定rhBMP-2/HA/Co復合制劑的生物活性，為其作為蓋髓劑和根尖誘導劑提供理論依據。方法:用全自動生化儀檢測rhBMP-2/HA/Co復合材料異位誘導成骨區樣本單位濕重的堿性磷酸酶(ALP) 活性，并與HA/Co組對照。結果:實驗組樣本的單位濕重堿性磷酸酶(ALP) 活性的平均值均明顯高于對照組。結論:rhBMP-2/HA/Co復合材料可作為一種新型的、具有良好生物活性的材料進一步研究，為將來的臨床應用打下基礎。

[關鍵詞]rhBMP-2;Ⅰ型膠原;羥基磷灰石;生物活性;小鼠;堿性磷酸酶

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)04-0521-03

Determining the ALP activity in ectopia osteogenesis of rhBMP-2/HA/Co compound

JIANG Yue-gui1，SUN Bin2，GOU Jian-zhong2，WANG Bao-yan2，SONG Jian-lin2，SUN Mo-yi3

(1. Department of Endodontics， the Affiliated Stomatological Hospital， Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，Shaanxi，China; 2. The Affiliated Stomatological Hospital， Medical School of Xi′an Jiaotong University， Xi'an 710004， Shaanxi，China; 3. Department of Oral and Maxillofacial Surgery， Stomatological College， the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveDetermining the biological activity of rhBMP-2/HA/Co in order to use them in pulp capping and apexification.MethodsAutomatic Chemistry Analyzer be used to evaluating the ALP activity of every sample-unit-wet-weight of rhBMP-2/HA/Co and HA/Co.ResultsThe average value of ALP activity in all samples unit-wet-weight of rhBMP-2/HA/Co group were apparently higher than those of HA/Co group.ConclusionWith fine biological activity， rhBMP-2/HA/Co compound can be studied furtherly to find out their application.

Key words:rhBMP-2;typeⅠcollagen;Hydroxyapatite;biological activity;mice;ALP

重組人骨形態發生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2， rhBMP-2)是一種高效骨生長因子，可異位誘導軟骨和骨的形成，但單獨使用時有局限性。復合了載體材料后的rhBMP-2具有更高效的誘導成骨活性，同時還可以減少rhBMP-2的用量[1]。本研究將rhBMP-2與生物相容性好、有骨傳導能力的Ⅰ型膠原(typeⅠcollagen， Co)和羥基磷灰石(hydroxyapatite， HA)復合，檢測復合材料異位誘導成骨部位的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)活性，確定復合物的生物活性，為進一步將其作為蓋髓劑和根尖誘導劑提供依據。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器:rhBMP-2(中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎研究所，中國)、Ⅰ型膠原(四川大學生物材料工程公司，中國)、HA(四川大學生物材料工程研究中心，中國)、Ca(0H)2(上海第二醫科大學，中國)、透析袋(Pierce Chemical公司， 美國)、全自動生化儀(HITACHI公司，日本)。

1.2 材料的制備:用鹽酸胍溶解法[2]分別制備rhBMP-2/Co/ HA和 HA/Co復合材料。將經過活性檢測的rhBMP-2 完全溶解在4mol/L的鹽酸胍溶液中，制成懸浮液。按比例加入?型膠原，待其溶解后，加入羥基磷灰石充分混勻。室溫擱置12hr，真空排氣30min，對50倍三蒸水于4℃ 透析72hr，每12h換一次液，冷凍干燥。?型膠原與羥基磷灰石(HA/Co)復合方法同上。將2種復合材料10mg/份分裝。環氧乙烷熏蒸消毒。-20℃冰箱保存。使用時每份加入80g/L的甲硝唑，用生理鹽水調成糊狀。

1.3 實驗分組:實驗組:rhBMP-2/HA/Co(含rhBMP-20.025mg/mg復合材料);對照組:(載體組)HA/ Co。

1.4材料的植入:取昆明種雄性小白鼠9只，體重18～20g。每只小鼠的兩個后肢隨機分為2組。實驗組和對照組各有9個實驗部位。乙醚吸入麻醉，采用小鼠后肢肌囊模型，剪毛消毒，切開皮膚，鈍性分離暴露股部外側肌肉的肌間隙，分別植入實驗組及對照組復合材料10mg/部位。分層縫合，標記。

1.5 標本的處理:術后2周處死小鼠。切取植入區組織，將樣本一分為二，一半用于堿性磷酸酶(ALP)活性測定，另一半做其它指標檢測。

1.6 堿性磷酸酶活性(ALP)測定:每個樣本的一半做標記，精確定量。常溫下置于勻漿器中，加入2ml生理鹽水研磨成勻漿，吸入離心管中。先后用2ml生理鹽水洗勻漿器2次，均吸入同一離心管中，1000 r/min，離心10min。取上清液0.5ml在HITACHI全自動生化儀檢測堿性磷酸酶(ALP) 活性。每個樣本讀值3次，取平均值，均以樣本濕重為除數，求得每毫克濕重樣本中的ALP活性(U/g)。

2結果

實驗組和對照組材料植入2周后，單位濕重樣本中堿性磷酸酶活性測定結果(表1)。經配對t檢驗，t=8.826>t0.01，P<0.01。統計學檢驗結果:兩組數據的平均值有顯著性差異，實驗組單位濕重樣本中的ALP活性明顯高于對照組。

3討論

3.1 關于rhBMP- 2及其載體:rhBMP-2具有良好的骨誘導作用。有關其載體的研究發展迅速。作為rhBMP-2的載體，應具備以下特點:①多孔性;②骨引導活性;③可生物降解，而且必須有適宜的降解速度，降解太快起不到支架及骨引導作用，降解太慢又妨礙新骨的形成;④具有一定的機械強度和良好的可塑性。目前作為rhBMP-2載體的材料主要有生物陶瓷，如HA、TCP等，高分子聚合物如聚乳酸等，骨基質、Ⅰ型膠原等[3]。

Ⅰ型膠原具有良好的生物相容性、生物降解性及較高的抗張強度和彈性，能夠支持多種不同組織的成長并兼具力學性能，其多孔的海綿狀結構是良好的藥物釋放系統，可根據臨床醫學應用的不同目的制成不同性能、形狀的復合材料，且作用不受移植部位的影響，具有良好的骨傳導活性，是rhBMP-2較理想的載體[4]。但單獨植入鼠的肌體內未見成骨現象[5]。羥基磷灰石無毒，強度大，在成分和結構上與人骨相似，具有良好的生物相容性和骨傳導活性[4]。

在軟組織中誘導骨形成必需具備三個基本條件，即誘導因子，靶細胞和適宜的環境。最理想的部位是肌肉、筋膜和骨髓等部位[6]。大量實驗研究證實了rhBMP-2與其它人工材料復合后具有良好的生物活性[7-8]。這些結果均表明rhBMP-2可直接作用于成骨細胞，刺激成骨細胞的表達。含有重組人骨形態發生蛋白2 的骨修復材料(骨優導)已經作為國內第1 個III 類醫療器械注冊并獲得國家食品藥品監督管理局(SFDA)的批準[9]。

3.2關于堿性磷酸酶及本實驗:本研究通過鹽酸胍溶解法制備出rhBMP-2/Ⅰ型膠原/羥基磷灰石復合材料，將rhBMP-2制成溶液，將疏松多孔的膠原膜浸入溶液中，rhBMP-2可隨液體進入膜的孔隙內，再用透析的方法濾去鹽酸胍，這樣rhBMP-2與膠原膜的復合較為完全而且均勻。

BMP可刺激分化表型標志物的表達，如堿性磷酸酶、骨鈣的合成等。Takuwa等[10]報道了在成骨細胞培養基中BMP-2刺激堿性磷酸酶活性和膠原合成的研究結果。樣本的堿性磷酸酶ALP活性與骨形成高度相關，是反映骨細胞活性增加的重要標志。堿性磷酸酶活性是檢測骨形成的量化指標的常用方法[10-11]。在本研究中，實驗組和對照組單位濕重樣本中堿性磷酸酶活性的均值經統計學對比顯示具有顯著性差異。說明與對照組相比，實驗組復合材料具有異位誘導成骨的能力。

該復合材料具有良好的骨誘導能力可能的原因是:①材料復合后rhBMP-2能夠發揮良好的誘導成骨活性;②本研究的復合方法:即將rhBMP-2和Ⅰ型膠原溶解、加入羥基磷灰石，然后透析、凍干的復合方法，可使復合物的結構更容易牢固吸附rhBMP-2，降低了rhBMP-2在體內的降解率，使其在局部發揮更為持久的生物誘導活性作用;③用Ⅰ型膠原蛋白和羥基磷灰石作載體不僅保留了rhBMP-2的生物活性，而且還可提供有利于骨質沉積的支架，避免了BMP的快速破壞，減少了BMP的用量。本實驗因條件所限，未能制備出不同濃度梯度的rhBMP-2/Ⅰ型膠原/羥基磷灰石復合材料，無法了解復合材料誘導成骨的量效關系中rhBMP-2最佳濃度。但在本研究中，每只小鼠植入的復合材料是10mg，僅含rhBMP-2 0.25mg，即能夠異位誘導成骨。

綜上所述，本研究用鹽酸胍溶解法復合的rhBMP-2/HA/Co具有良好的生物活性。可作為蓋髓劑、根尖誘導劑進一步進行動物實驗研究。

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[收稿日期]2009-12-22 [修回日期]2010-03-20

編輯/張惠娟