SD大鼠坐骨神經對腺樣囊性癌細胞系ACC-M體外增殖能力的影響

[摘要]目的:研究SD大鼠坐骨神經對腺樣囊性癌ACC-M細胞體外增殖能力的影響。方法:將人腺樣囊性癌細胞系(ACC-M)分別與條件培養液和坐骨神經培養液共培養24、48、72h。應用MTT比色法研究SD大鼠坐骨神經對腺樣囊性癌ACC-M細胞體外增殖能力的影響。結果:坐骨神經培養液對ACC-M作用48和72h后，ACC-M細胞的增殖明顯高于其它組別，而共培養液則對ACC-M細胞的增殖沒有明顯影響。結論:SD大鼠坐骨神經培養液作用于腺樣囊性癌細胞，能有效促進腺樣囊性癌細胞的增殖，這可能是腺樣囊性癌嗜神經侵襲的基礎。

[關鍵詞]坐骨神經;腺樣囊性癌;增殖;嗜神經侵襲

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)04-0527-02

Effect of SD rat sciatic nerve on proliferation of Adenoid Cystic Carcinoma Cell Line

ACC-M in vitro

YANG Xiang-ming，SUN Mo-yi，CAI Bo-lei，JIA Wen-rong， LI Jian-hu

(Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Stomatological College，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of SD rat sciatic nerve on proliferation of adenoid cystic carcinoma(ACC).MethodsACC-M cell line was co-cultured with conditioned medium and sciatic nerve culture medium for 24，48 and 72 hours. MTT was used to detect the proliferation of ACC-M.ResultsThe proliferation of ACC-M cells incubated by sciatic nerve cultured medium for 72 hours was significantly higher than that of other groups. Co-cultured medium had no effects on the proliferation of ACC-M cells.ConclusionsSD rat sciatic nerve cultured medium can effectively promote the proliferation of ACC cells. This might be theoretic base of perineural invasion of ACCs.

Key words:sciatic nerve; adenoid cystic carcinoma(ACC); proliferation; perineural invasion

涎腺腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma， ACC)具有典型嗜神經性，易于侵襲神經并沿之生長，臨床上常導致疼痛、麻木以及面癱等神經損傷癥狀，這一特性嚴重影響臨床療效及預后，給臨床治療帶來很大困難。有研究[1-6]報道，神經組織分泌的神經細胞粘附分子NCAM、神經生長因子NGF、神經營養因子NT-3等小分子蛋白質可通過促進腫瘤細胞增殖的方式來影響ACC的嗜神經侵襲特性。本實驗通過MTT實驗方法來檢測SD大鼠坐骨神經培養液對腺樣囊性癌ACC-M細胞系增殖能力的影響，以進一步了解神經組織與腺樣囊性癌侵襲及嗜神經侵襲之間的關系。

1材料和方法

1.1 材料:人腺樣囊性癌高轉移細胞系ACC-M(上海交通大學附屬第九人民醫院口腔頜面外科建系);SD大鼠(第四軍醫大學動物實驗中心提供);牛血清白蛋白(即BSA，美國Sigma公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);RPMI1640培養基(美國Gibco公司);96孔板(美國Costar公司);市售青霉素、鏈霉素;MTT(即噻唑藍，美國Sigma公司);二甲亞砜(即DMSO，美國Sigma公司);DG5031型酶標儀(華東電子管廠)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:人ACC-M細胞系，RPMI1640培養液，由5%CO2，37℃，100%濕度培養箱連續培養，培養液為含10%胎牛血清的RPMI1640。選用對數生長期ACC-M細胞，棄去培養液，PBS液沖洗2次，加入0.25%胰酶，37℃孵箱中消化15min，加入含血清培養液，終止消化，以800r/min轉速離心3min。加PBS液離心漂洗3次，以含血清RPMI1640培養液制成單細胞懸液。用細胞計數板調整細胞濃度至4×104/ml。

實驗培養液的制備:無菌條件下，手術截取兩段SD大鼠坐骨神經各約3cm，顯微操作下仔細剝離神經外膜及血管，分別置于含10mlRPMI1640培養液的無菌細胞培養瓶中。其中一瓶接種對數生長期ACC-M細胞與坐骨神經共培養，以構建共培養液;另一瓶不做處理，單獨培養坐骨神經，作為坐骨神經培養液。48h后分別用10ml離心管收集培養液，4℃冰箱保存，備用。

體外細胞增殖能力的測定:將上述細胞懸液接種于96孔培養板。以24、48、72h三個時間點接種細胞，每個時間點接種的細胞分4組，每組設3個復孔，每孔接種細胞懸液100μl，使每孔含細胞4 000個。第1組為對照組，加入含10%胎牛血清的RPMI1 640培養液100μl;第2、3組為實驗組，分別加入共培養液、坐骨神經培養液各100μl。第4組為空白對照組，只加RPMI1 640培養液200μl，不加細胞。5%CO2、37℃、100%濕度孵箱中培養。

以24、48、72h時間點為準，實驗終止前4h，每孔中加入MTT應用液(5mg/ml)20μl，5%CO2、37℃、100%濕度孵箱中培養4h。終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加二甲亞砜溶液150μl，震蕩10min，以空白對照孔(無細胞)在DG5031型酶標儀上調零，測定490nm吸光度值。檢測各孔的OD值減去空白對照組OD值為其實際數值。

1.2.2統計學分析:運用第四軍醫大學統計學教研室SPSS統計軟件(版本12.0)進行t檢驗比較不同時間點各組ACC-M細胞的增殖水平。

1.3 結果:在一定細胞數量內，MTT結晶物形成量與細胞數量成正比，應用酶聯免疫檢測儀在490nm波長測定的吸光度可間接反映活細胞數量。本研究發現，在坐骨神經培養液作用48、72h后，ACC-M細胞的OD值明顯高于其他組(P<0.01)。說明此2組中ACC-M細胞數量增殖顯著。

2討論

涎腺腺樣囊性癌具有典型嗜神經性，即易于侵襲神經并沿之生長，臨床上常見患者面癱、疼痛、麻木以及顱內神經轉移等報道。侵襲行為是腫瘤播散的第一步，研究涎腺腺樣囊性癌沿神經播散的機理，就必須研究腫瘤細胞在神經周圍生存和增殖的機制。Ayala等[7]通過對前列腺癌嗜神經侵襲相關的腫瘤增殖機制的研究，提出了前列腺癌細胞通過NF-κB通路提高神經周圍癌細胞增值能力的觀點。Meggiato等[8]的研究發現具有外周神經侵襲特點的胰腺癌MIB-1水平顯著提高，說明胰腺癌在神經周圍的增殖水平高于其它部位。Iwamoto等[9]發現，惡性黑色素瘤表達的p75NTR與其配體NGF結合后，能夠有效促進惡性黑色素瘤細胞增殖，從而使惡性黑色素瘤細胞表現出嗜神經侵襲的特性。

Fukuda等[1]研究發現，神經細胞粘附分子NCAM在人類涎腺腫瘤細胞株(HSGcell)中表達，可以使胱門蛋白酶-23、7、9失活，從而抑制腫瘤細胞的程序性細胞凋亡;并發現由轉化生長因子-β1(TGF-β1)介導的NCAM表達上調可能促進NCAM發生同型粘附，從而進一步促進HSG細胞株增殖。這表明NCAM可能通過促進涎腺惡性腫瘤細胞的粘附和增殖來影響其侵襲神經的生物學行為。羅小龍等[2]報道一定濃度的神經生長因子NGF能有效促進腺樣囊性癌細胞的體外增殖。郭峰等[3]采用NGF抗體干預ACC細胞增殖的研究方法，反證了NGF能以劑量依賴的方式促進ACC細胞增殖。這表明，NGF可能以促進ACC細胞增殖的方式來促進ACC的嗜神經侵襲。孫沫逸[4-5]，王磊[6]等的在涎腺腺樣囊性癌嗜神經侵襲相關研究中發現，神經營養因子3(NT-3)及其高親和力受體TrkC在具有嗜神經侵襲表現的腺樣囊性癌中存在過表達現象。推測一方面這可能由于神經纖維分泌的NT-3可能在神經周圍的微環境中形成一定的濃度梯度從而促進腫瘤細胞的增殖并增強腫瘤細胞的侵襲;另一方面腫瘤細胞通過自分泌或旁分泌產生NT-3及其受體，誘導神經纖維定向生長最終造成腫瘤侵襲神經。以上筆者可以看到，涎腺腺樣囊性癌嗜神經侵襲的特性可能是涉及腫瘤和神經兩方面的多種原因造成的，而關于神經組織對ACC細胞增殖作用影響的研究未見報道。

因而筆者采用MTT法研究SD大鼠坐骨神經對人腺樣囊性癌ACC-M細胞系增殖的作用。本研究中，筆者發現單純坐骨神經培養液作用于ACC-M細胞后能顯著提高ACC-M細胞的增殖水平;而共培養液對ACC-M細胞的增殖則沒有明顯影響，這可能是由于坐骨神經分泌的能夠促進ACC-M細胞增殖的相關因子在共培養過程中被消耗，因而喪失了對ACC-M細胞增殖能力的影響，從而驗證了單純坐骨神經培養液的作用。這說明，SD大鼠坐骨神經可能通過自身分泌的因子來促進ACC-M細胞的增殖，這可能是腺樣囊性癌嗜神經侵襲這一生物學行為的基礎。筆者的研究表明神經組織對涎腺腺樣囊性癌細胞的增殖具有較為明顯的促進作用，但是具體是哪些因子獨自或者協同，通過何種信號通路在發揮作用，還有待進一步探討和研究。

[參考文獻]

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[2]羅小龍，呂春堂，周中華，等.神經生長因子對腺樣囊性癌細胞系增殖與凋亡的影響[J].口腔頜面外科雜志，2006，16(3):205-208.

[3]郭峰，呂春堂，李保平，等.神經生長因子對腺樣囊性癌細胞增殖的影響[J].口腔頜面外科雜志，2006，16(4):307-309.

[4]孫沫逸，王磊，陸斌，等.酪氨酸激酶C與涎腺腺樣囊性癌嗜顱神經侵襲的關系[J].中國神經外科疾病研究雜志，2004.3(4):334-336.

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[8]Meggiato T，Calabrese F，Valente M，et a1.Spontaneous apoptosis and proliferation in human pancreatic cancer[J].Pancreas，2000，20(2):l17-l22.

[9]Iwamoto S，Odland PB，Piepkorn M，et a1.Evidence that the p75 neurotrophin receptor mediates perineural spread of desmoplastic melanoma[J].J Am Acad Dermatol，1996，35 (5 Pt l):725-731.

[收稿日期]2009-12-27 [修回日期]2010-03-09

編輯/張惠娟