甜櫻桃品種SSR指紋圖譜的構建

摘要：采用SSR標記技術構建甜櫻桃品種的分子指紋圖譜。為甜櫻桃品種鑒定提供依據。以“泰山朝陽”、“泰山紅日”和“紅南陽”等品種為試材，從38對引物中篩選出5對多態性及穩定性高的SSR引物進行PCR擴增。5對引物擴增出的多態性帶數在10～15條，平均為12.6條；引物的多態信息量(PIC)在0.8347~0.9020，平均0.8708。依據甜櫻桃SSR帶型特征，對每對引物生成的不同帶型直接編號，簡化甜櫻桃SSR帶型記錄方法，并利用每個品種的帶型編號，建立其DNA指紋圖譜。表明SSR標記技術可用于鑒定甜櫻桃種質。

關鍵詞：甜櫻桃；SSR；指紋圖譜

中圖分類號：S662.5；Q503 文獻標識號：A 文章編號：1001－4942(2010)04－0008－03

隨著新品種的推廣應用，進行品種鑒定、保證品種的真實性、維護生產者與育種家的權益顯得日趨重要。傳統上一般采用形態性狀進行品種鑒定，鑒定周期長、可靠性較低。分子標記技術的發展為品種鑒定提供了新的途徑。對甜櫻桃等果樹作物的研究表明，SSR標記具有數量豐富(分布于整個基因組)、等位變異高、共顯性、檢測簡單、結果穩定可靠等優點，在品種鑒定等方面得到了廣泛應用。目前，櫻桃屬(Cerasus)中也發展了一些SSR標記，并已應用于遺傳多樣性分析、品種進化分析等方面，但利用SSR標記構建品種指紋圖譜的研究鮮見報道。筆者利用SSR標記建立了甜櫻桃栽培品種的分子身份證，確立一套簡捷而準確的種質鑒定方法體系，為在分子水平上區分甜櫻桃種質材料和知識產權保護提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以“泰山朝陽”、“泰山紅日”和“紅南陽”等甜櫻桃主栽品種為試材，采自泰安省莊和肥城大-王莊甜櫻桃生產基地，選田間生長健壯、無病蟲害危害植株的幼嫩葉片，保存于－70℃備用。

1.2 DNA提取

采用改良的CTAB法提取甜櫻桃葉片的基因組DNA，并進行DNA樣品的濃度和純度測定。

1.3 PCR擴增和電泳檢測

反應體系(20μl)中含有10×PCR buffer 2.0μl，2.5

mmol/L dNTPs 1.5μl，MgCl，(2.5 mmol/L)1.5μl，1 u Taq DNA聚合酶，SSR上、下游引物(5 pmol/μl)各1μl，50～100 ng模板DNA。

PCR擴增程序：94℃預變性5 min；然后94℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸1 min，共28個循環；最后72℃延伸7 min。采用6％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產物。

1.4 圖譜構建方法

借鑒小麥帶型記錄的方法，根據每對SSR引物生成帶型間的差別直接對帶型進行分類編號，可得到每個品種的帶型編號，一個品種的DNA經過不同引物擴增后，將獲得一系列帶型編號，按照固定的引物序列，串聯各帶型編號，形成一組數據，便形成了該品種的分子指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 SSR引物的篩選

從38對來自薔薇科的SSR引物中篩選出能夠擴增出穩定帶型且不同品種之間差異明顯的引物，從中選出5對多態性高、重復性好、分辨率高的SSR引物作為標準引物(表1)，以用于構建甜櫻桃品種的DNA指紋圖譜。

2.2 標準圖譜的建立

針對甜櫻桃SSR帶型識別和記錄中因帶紋繁多和分布復雜而造成帶紋判讀和記錄困難的難點，我們借助了小麥SSR帶型記錄的快捷方法對SSR引物生成帶型進行編號建立標準帶譜，以有效簡化甜櫻桃SSR帶型記錄方法。該方法避免了由于錯誤判斷引起的實驗誤差，并可利用每個品種的帶型編號，建立品種(系)的DNA指紋。將5對引物依次用英文字母A、B、C、D、E表示，每個引物生成的有差別的帶型用該引物的字母代號和阿拉伯數字表示。用5對不同引物對每一品種進行擴增，將每對引物在該品種中擴增出的帶型與每對引物的標準帶譜進行比較歸類，這樣每個品種將會有5個由英文字母和阿拉伯數字組成的代碼，這一代碼即是該品種的分子指紋圖譜。“泰山朝陽”、“泰山紅日”和“紅南陽”3個甜櫻桃品種的分子指紋圖譜代碼分別為A2 B2 c9 D2E3、A7 B6 cl D7 E13和A7 B6 C10 D7 E5，其分子指紋圖譜見圖1。

3 結論與討論

SSR標記是近年來發展起來的建立在PCR基礎上的第2代分子標記，其具有RFLP的所有遺傳學特點，但避免了RFLP技術中使用放射性同位素的缺點，又比RAPD的重復性和穩定性高，因而成為目前遺傳標記的熱點。SSR帶型的識別和記錄是甜櫻桃材料DNA指紋形成與數據庫建立的重要基礎。對于甜櫻桃帶型種類多、每種帶型的帶紋數目多、帶紋分布不均勻的特點，用1和0記錄每條帶紋就非常困難。參照小麥帶型記錄方法，即為每種帶型賦予不同的編號以示區別。在確定待測品種某SSR位點的帶型時，將待測品種的SSR帶型與該引物標準帶型在同一塊膠上電泳，進行比對，便可確定待測品種的帶型編號。更重要的是如果增加引物數量或增加試驗材料，有可能會增加不同的帶型，這樣可以繼續用英文和阿拉伯數字表示增加的引物和帶型，不影響以前的記錄結果，方便易行。可見按帶型記錄帶型編號比用1和0記錄帶型代碼，更加快捷且避免了錯判。另外由于帶型編號用英文字母與阿拉伯數字相結合，不容易產生記錄筆誤，更直觀、更簡單。

選擇合適的引物是構建甜櫻桃分子指紋圖譜的前提之一，我們在進行2次篩選的基礎上，選出5對多態性高、重復性好的引物進行圖譜構建。從數據分析中發現，不同的引物對品種(系)間多態性的鑒別能力有較大差異。每對引物都不能單獨區分開所有供試材料。任2對或3對引物組合也不能將所有供試材料區分開，可將供試材料完全區分開的引物組合至少為4對。根據最小差異原則，可以利用特定品種(系)的單一譜帶將其從所有材料中區分開，然后再利用引物組合區分其他材料。考慮到鑒別品種指紋的可信度和準確性，我們將5對引物全部組合來繪制甜櫻桃的指紋圖譜。但有限的引物只能適用于一定數量的樣本群體，對于所有的甜櫻桃品種或出現新品種時，難免會出現同一引物在不同品種間出現相同譜帶的現象，此時應采用不同的引物組合或者篩選新的SSR引物將其區分開，以補充和擴展現已建立的初步指紋圖譜。