高低溫脅迫對番茄葉片抗壞血酸代謝系統(tǒng)的影響

摘要：為探明番茄在溫度逆境下抗壞血酸(AsA)代謝系統(tǒng)抗氧化的生理機制，以番茄幼苗為試材，分別研究了高溫(40℃)和低溫(5℃)脅迫(0、4、8、12、24、36 h)下，葉片AsA代謝的主要酶L－半乳糖－1，4－內(nèi)酯脫氫酶(GalLDH)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、抗壞血酸過氧化物酶(APx)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性與AsA、脫氫抗壞血酸(DHA)和AsA+DHA含量的變化。結果表明：在高溫和低溫脅迫下，除36 h外，番茄葉片AsA、DHA和A8A+DHA含量和GalLDH、DHAR、APX、MDHAR及GR活性均明顯高于25℃(CK)處理，H2O2含量始終明顯高于CK，AsA/DHA始終明顯低于CK，說明短時間(24 h)高溫和低溫脅迫，番茄幼苗以AsA為核心的抗氧化系統(tǒng)功能明顯增強，但長時間(36 h)溫度脅迫，AsA抗氧化系統(tǒng)的功能明顯下降，導致H2O2的積累。

關鍵詞：番茄；高溫；低溫；抗壞血酸；抗壞血酸系統(tǒng)

中圖分類號：S641.201 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942(2010)04-0022-05

番茄屬喜溫不耐熱的蔬菜，夏秋露地以及日光溫室和大棚栽培，常遇35℃以上高溫，往往導致其生育異常；番茄對低溫也較敏感，8℃時生長發(fā)育嚴重受阻，5℃時生長完全停止。因此，溫度逆境成為影響番茄產(chǎn)量和品質的主要因素之一。

高溫和低溫均會導致植物活性氧自由基積累，進而形成氧化脅迫。通過調節(jié)自身的抗氧化系統(tǒng)，植物可清除活性氧自由基而免受或減少傷害。以抗壞血酸(AsA)為核心的抗氧化系統(tǒng)在植物清除活性氧過程中具有重要的作用。植物AsA代謝途徑已較為明確，AsA主要是通過半乳糖途徑合成，L一半乳糖－1，4-內(nèi)酯脫氫酶(GalLDH)為催化該途徑最后一步反應的關鍵酶。AsA在抗壞血酸過氧化物酶(APX)作用下氧化生成單脫氫抗壞血酸(MDHA)。MDHA經(jīng)非酶歧化反應形成脫氫抗壞血酸(DHA)。兩者分別通過單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、谷胱甘肽還原酶(GR)的作用被還原再生。因此，GalLDH、APX、MDHAR、DHAR和GR為影響AsA代謝的重要酶，并被證明參與植物對活性氧的清除作用。

目前，有關番茄在溫度逆境下AsA代謝系統(tǒng)的變化尚未見報道。本試驗以番茄幼苗為試材，旨在探明其在溫度逆境下AsA代謝系統(tǒng)抗氧化的生理機制，以期為番茄在栽培中抵御溫度脅迫提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試材番茄品種為“S以12粉”，由青島市農(nóng)業(yè)科學研究院蔬菜花卉研究所提供。選取飽滿種子，催芽后播種在含草炭、蛭石和羊糞(體積比為3：2：1)的營養(yǎng)缽中。待植株長至7～8片真葉時，選長勢一致者移至光照培養(yǎng)箱[光照強度55.63μmol/(m²·s)]進行溫度脅迫。設25℃(CK)、40~C(高溫)和5~C(低溫)3個處理。均于處理的0、4、8、12、24和36 h，分別取幼苗頂端下第3～4片葉測定各項指標。每處理重復3次，樣品經(jīng)液氮冷凍后，－80℃超低溫冰箱保存。

1.2 測定方法

1.2.1 酶活性測定 GaILDH和MDHAR活性分別采用Tabata等(2001)和Jim6nez等(1997)的方法測定；GR、APX活性參照Pignocchi等(2006)的方法測定。

DHAR活性參照Chen等(2003)的方法加以改進。取0.5 g番茄葉片在4 ml提取緩沖液(含50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，100 mmol/L NaCI，2 mmol/L EDTA和l mmol/L MgCl2)研磨勻漿，12 000×g離心10 min。取100μl提取液，加1.9 ml反應液(含25 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH 7.0，0.1 mmol/L EDTA，3.5 mmol/L GSH，0.4 mmol/L DHA)。紫外分光光度計測定265 nm下吸光值變化。

1.2.2 AsA、DHA和AsA+DHA含量測定AsA含量測定參考Tures(myi等(2000)及Takahama和Onik(1992)提供的方法并作適當改進：稱取約0.5 g番茄葉片在5％的偏磷酸中研磨勻漿，于4℃下12 000×g離心20 min，收集上清液用于測定AsA和DHA的含量。測定AsA時，吸取一定量的如上提取液加至100 mmol/L磷酸鉀緩沖液2Inl(pH 6.8)中，當加入1 u的抗壞血酸氧化酶(EC 1.10.3.3，from Cucurbita sp.)后記錄265nm下的吸光值變化。測定DHA時，吸取一定量提取液加至100 mmol/L磷酸鉀緩沖液2 ml(pH6.8)中，當加入2 mmo~L DTr后開始記錄265nm下的吸光值變化。同時，用一系列已知濃度的AsA和DHA(sigma)溶液用相同的方法作標準曲線以計算樣品中AsA、DHA和AsA+DHA含量。

1.2.3 H2O2含量測定H2O2的測定參照Petrie和Jaekson(1984)的方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel軟件分析數(shù)據(jù)和做圖，采用DPS統(tǒng)計軟件中的Duncan新復極差法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 溫度脅迫下AsA、DHA和AsA+DHA含量及AsA/DHA比值

如圖1所示，CK(25℃)番茄葉片AsA含量變化不大，但40℃和5℃兩者AsA含量均呈先增加后下降趨勢，且均在脅迫的12 h達到高峰，分別較CK增加58.3％和33.3％，而后急劇下降。CK番茄葉片DHA含量變化不大，但40℃和5℃兩處理DHA含量均呈先增加后下降趨勢，且在脅迫的12 h達到高峰，分別較CK增加72.9％和61.6％，而后急劇下降，但40℃處理最終仍顯著高于CK。AsA+DHA含量變化趨勢與DHA含量基本一致；而AsA/DHA比值在40℃和s℃脅迫下。均始終明顯低于CK。

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2.2 溫度脅迫下GalLDH活性

如圖2所示，40℃和5℃下，番茄葉片GalLDH活性變化基本一致，脅迫的4 h內(nèi)均變化不大，但隨后均急劇增加至12h達到高峰，分別比CK增加139.5％和113.3％，而后又急劇下降，36h時顯著低于CK；但CK番茄葉片GalLDH活性在處理過程中變化很小。

2.3 溫度脅迫下MDHAR和DHAR活性

如圖3所示，40℃和5℃下，番茄葉片MDHAR活性具有相同的變化規(guī)律，均呈單峰曲線，在12 h達到高峰，分別比CK增加152.3％和130％。之后迅速下降，在36 h顯著低于CK。DHAR活性變化和MDHAR活性變化規(guī)律基本一致，在12 h達到最高值，分別比CK增加220.1％和173.8％，之后迅速下降。由圖3可明顯看出，CK番茄葉片MDHAR和DHAR活性在處理過程中均變化很小。

2.4 溫度脅迫下APX活性

如圖4所示，40％和5℃兩處理的番茄葉片APX活性均始終明顯高于CK，在8 h內(nèi)兩處理APX活性增加緩慢，隨后增加迅速，在12 h達到高峰，分別比CK增加147％和155.8％，之后迅速下降，但36 h時仍顯著高于CK。

2.5 溫度脅迫下GR活性

由圖5看出，40℃和5℃下，番茄葉片GR活性均逐漸增加，12 h達到高峰，分別比CK增加62.4％和36.7％，之后迅速下降，在36 h均顯著低于CK，但CK番茄葉片GR活性在處理過程中變化很小。

2.6 溫度脅迫下H2O2含量

如圖6所示，40℃和5℃兩處理的番茄葉片H2O2含量均始終明顯高于CK，兩者均快速增加，8h達到高峰，分別比CK增加47.6％和52.2％，12 h后明顯下降，24 h后40℃處理H2O2含量又明顯增加，而5℃處理變化不大。

3 討論與結論

溫度逆境對植物的傷害涉及到其體內(nèi)一系列生理效應的變化，而活性氧的積累及其所引起的氧化脅迫被認為是植物受冷熱傷害的重要原因。因此，作為植物體內(nèi)重要的抗氧化物，抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)是植物體內(nèi)普遍存在的一種高豐度小分子抗氧化物質，可以直接清除O2·)、H2O2和·OH等活性氧自由基(ROS)，其中一個重要功能是保護葉綠體免于氧化損傷，因此在植物抵抗生物和非生物脅迫中具有重要作用。相當多的研究資料表明，AsA的含量、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA)及其合成代謝相關酶類活性的變化是植物對一系列環(huán)境脅迫的響應。本試驗結果表明，番茄在高低溫脅迫下，AsA含量及其代謝相關酶活性顯著增加，說明以AsA為核心的抗氧化系統(tǒng)參與了清除活性氧，提高了番茄的抗性。

H2O2被認為是一種導致植物氧化脅迫的活性氧分子和植物細胞應答環(huán)境變化所產(chǎn)生的重要信號分子。本試驗中，在高溫和低溫脅迫初期，番茄葉片H2O2含量均迅速增加，誘發(fā)了以AsA為核心的代謝相關酶活性的迅速增強，AsA及AsA庫含量也逐漸增加。同時APX活性增強，AsA參與H2O2的清除被消耗，其最終產(chǎn)物DHA含量不斷增加，AsA/DHA快速降低。說明在溫度脅迫下，以AsA為核心的抗氧化酶系統(tǒng)參與了番茄抵御高溫和低溫逆境的自我保護反應，并通過調節(jié)AsA水平，保護植株抵御溫度逆境引起的氧化傷害。H202含量在8～24 h的下降也體現(xiàn)了這一點(圖6)。然而，隨著脅迫時間的延長，GalLDH和DHAR活性以及MDHAR和GR活性于脅迫12 h后開始下降，表明以AsA為核心的抗氧化系統(tǒng)功能逐漸降低，AsA/DHA也開始下降。同時，AsA是APX維持活性清除H20z所必需的。AsA的缺乏，使得APX的活性在12 h后也急速下降，從而導致H202開始積累，誘發(fā)膜脂過氧化水平加劇。羅亞等(2007)在冷處理草莓和Ma等(2008)熱處理蘋果所測定的AsA代謝相關酶活性的變化也獲得了相似的結果。