大白菜EST-SSR標記開發中非SSR標記的鑒別

摘要：EST－SSR標記開發過程中經常會遇到一些問題，例如引物重復設計等。本試驗對從大白菜EST序列中開發的30個多態性SSR標記產生的多態性條帶進行測序，結果發現有一些標記的多態性并不是由于其所含有的簡單重復序列重復次數的改變引起的，這類標記約占鑒定標記總數的13％。這些標記實際上屬于EST－SCAR標記。在進行SSR變異對基因表達及功能影響方面的研究時。這類非SSR標記應該被排除。

關鍵詞：EST－SSR；標記開發；多態性；測序；大白菜

中圖分類號：S634.1；Q503 文獻標識號：A 文章編號：1001－4942(2010)04－0001－04

簡單重復序列(simple sequenee Repeats，SsR8)，又稱微衛星(microsateuite)序列，因其具有多態性高、穩定性好、易于操作、呈共顯性以及遍布整個基因組等特點而成為非常理想的遺傳標記。近些年來，由于許多作物的大量EST序列得以測序，這為利用EsT序列開發新的遺傳標記包括EsT－SSR提供了基礎。利用公共數據庫中大量的EST序列開發SSR等標記，免去了傳統的從基因組中開發標記時需要的克隆、測序等步驟，對開發標記而言具有省時、省力、費用低等特點。所開發出的引物由于來自于功能基因區，該區域在近緣物種中相對保守，因而具有良好的可轉移性，可以用于比較基因組學等研究。在評價作物種質資源多樣性時，人們更希望能了解資源材料中功能基因的多樣性。來自功能基因區的EST－SSR標記，其多態性往往低于非功能基因區的genomic－SSR標記，這被認為是基因功能限制了SSR變異的結果，因而人們認為EST－SSR標記是一種功能性的遺傳標記，EST－SSR提供了良好的功能基因多樣性評價的工具。正因為EST－SSR標記具有上述特點，目前人們已經在許多作物中開發了很多EST－SSR標記。

在實際開發EST－SSR標記的工作中常常會遇到一些問題，如引物重復設計、擴增產物含內含子、引物跨越內含子與外顯子界限、EST序列質量低等等，這些問題可以通過適當的方法得以解決。我們在開發大白菜EST－SSR引物過程中遇到的另一個現實問題是開發出的EST－SSR引物擴增出的多態性并不是由SSR位點簡單重復次數改變所引起的。這一點常常為人們所忽視，但在利用這些引物進行功能基因多樣性評價或進行SSR位點變異對基因表達及功能影響等方面的研究時，這又是客觀的不應該忽視的問題。

1 材料與方法

1，1試驗材料及DNA提取

開發引物多態性驗證所用的材料為山東省農業科學院蔬菜研究所收集保存的大白菜自交系及地方品種共8個。分別為：白引1號、白引2號、膠州白菜、掖縣豬嘴、李樓中紋、福山包頭、河頭早、黑56。

苗期采用常規的CTAB法提取各大白菜自交系及地方品種的DNA。

1.2 EST序列來源以及片段置疊群(config)構建及引物設計

從NCBI公共數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)中下載到大白菜EST序列147 217個。對這些序列參照葛佳等的方法進行前期處理，包括除去EST序列中存在的載體序列polyT(5’端)和pdyA(3’端)序列、含有歧義堿基(ambiguous bases)的序列、小于100 bp的序列。然后利用SeqMan程序(Lasergene軟件包，DNAStar Inc.)對處理后的EST序列進行重疊群(configs)構建。用MISA軟件(http：//WWW.pgrc.ipk－gateleben.de/misa)在構建的重疊群中篩選SSR標記，標準參見Zhang等。對篩選到含SSR的重疊群用Primer Premier 5.0(http：//www.PremierBiosoft.com)軟件設計引物。

1.3 SSR標記多態性檢測

設計的SSR引物在上海生工合成，溶解后稀釋成2 μmol/L備用。PCR采用20μl反應體系：40 ng模板DNA，1×PCR buffer(含20 mmol/LMgcl2)，200 μmol/L NTP8，引物0.1 μmol/L，1 uTaqDNA聚合酶。擴增程序為：95℃預變性5min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1min，共計35個循環；72℃延伸lO min。4~C 10min終止反應。PCR產物經6％聚丙烯酰氨凝膠電泳后銀染檢測。

1.4 多態性條帶的回收及測序

切下凝膠板上各材料間呈多態性的條帶，置入10μl超純水中95℃加熱5 min，冷卻，短暫離心后上清液稀釋10倍進行二次PCR擴增，PCR產物回收后用TA克隆載體(天根生化有限公司)，克隆后在諾塞基因公司測序。每個條帶各做一次重復。測序結果用MEGA4.0軟件進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 EST－SSR引物的設計及多態性檢測

對147 217個大白菜EST序列經過處理和拼接后得到31 519個重疊群序列。從其中4 000個重疊群序列中發現了1145個SSR位點。對其中400個SSR位點設計了引物，其中230個可在大白菜8個材料中獲得清晰的擴增條帶，105個在8個材料中顯示出多態性。引物BREl44是一對多態性引物，根據重疊群contigl335設計，擴增區域含有8個二堿基Tc重復，其上游引物序列為：5’－AAACCTrrCCGTATAATGTC－3’，下游引物序列為5’－TGCTGATrCTrCTFGCTFC－3’，在大白菜8個自交系及地方品種中的擴增產物電泳后的結果見圖1。

2.2 多態性條帶測序結果

為了檢測多態性引物擴增的多態性條帶的大小，我們對30對多態性引物擴增的多態性條帶進行了回收，二次PCR后進行了克隆與測序。測序結果表明，所有引物擴增的均為目的片段，其大小也在目標大小范圍內，重復間無差異。有26對引物的多態性是由SSR重復基序重復次數的改變引起的，另有4對引物(BRE48、BRE58、BREl44、BREl48)在不同材料間的多態性并不是由重復基序重復次數的改變引起的，而是由重復基序以外的堿基的插入與缺失引起的。BREl44對白引1號和河頭早的擴增條帶以及該引物所在重疊群序列的比對結果見圖2。

3 討論與結論

引物BREl44對大白菜8份材料共擴增出兩個等位變異，呈明顯的多態性(圖1)。但對多態性條帶的測序結果顯示，簡單重復序列(TC)n的重復次數在兩個等位變異中均無改變，都重復8次。但在第44～57位，河頭早明顯比白引1號多出14個堿基，在其它4個位置即第35、第8l～83、第116～117和第142～144位兩個序列間也存在堿基的插入缺失現象(圖2)。正是這些堿基的插入缺失突變造成了不同材料間的多態性。其它3對引物BRE48、BRE58、BREl48和BREl44情況相似，即這些引物在不同大白菜材料間擴增的多態性均是由SSR位點以外的堿基的插入缺失突變引起。這類引物大約占鑒定的30對多態性引物總數的13％。

堿基的替代、插入缺失、片斷重復是基因組進化過程中最常見的序列變異類型。EST序列來自功能基因，相對于基因組非基因區的序列，保守性較強，但并非絕對保守，尤其是在3’與5’端的非編碼區。EST－SSR標記的開發正是以EST序列中SSR變異為基礎的。EST序列中的其它變異例如堿基的替代、插入缺失等也常被用于開發EST－ShIP和EST－RFLP以及EST－SCAR等標記。本試驗經過測序表明在開發EST－SSR引物的過程中，所設計的BRE48、BRE58、BRE144和BRE148四個標記的多態性并不是由SSR的變異引起，因此它們實際上是屬于EST－SCAR標記，而不是EST－SSR標記。雖然這四個標記經測序證明不屬于SSR標記，但因其在大白菜不同品種中具有多態性，因此并不影響它們作為分子標記用于輔助育種、多樣性評價等項研究。

有實驗證據表明，EST序列中的SSR對基因的表達調控及基因的功能有著重要的影響，例如煙草花粉特異表達基因ntp303 5’－UTR區中的(GAA)s SSR位點通過形成stem－loop結構而對mRNA的翻譯效率起著重要的調節作用，當缺失掉這8個GAA重復后，融合基因熒光素酶的表達量比對照降低了94％。有人認為EST－SSR的多樣性影響到基因的功能，有必要對呈多態性的EST－SSR的變異與基因功能的改變及對基因表達的影響之間的關系進行研究，這對闡明基因功能的進化也是非常有意義的。進行這項研究前提是要鑒定出真正存在的SSR變異，本文提到的四個標記雖然都含有SSR，但事實證明在不同材料中出現的變異不是由于這些SSR變異引起的。因此這四個標記顯然不適合進行這方面的研究。因此我們建議在進行EST－SSR變異對基因功能影響方面研究時對引物擴增出的多態性條帶進行測序以鑒定出真正的EST－SSR標記。