板栗褐緣葉枯病病原菌生物學特性研究

摘要：本試驗對板栗褐緣葉枯病病原菌——板栗擬莖點霉菌生物學特性進行了研究。結果表明：病原菌菌絲在PSA培養基上生長最快；病原菌最易利用的碳源是葡萄糖，最易利用的氮源是氯化銨和甘氨酸；菌絲生長的最適溫度為25℃，最適pH值為5～6。病原菌分生孢子在清水及多種營養液中均可以直接萌發，孢子萌發最適溫度為20～30℃，最適相對濕度為85％，最適pH值為50

關鍵詞：板栗褐緣葉枯病；病原菌；生物學特性

中圖分類號：Q949.32 文獻標識號：A 文章編號：1001－4942(2010)04－0052－04

板栗是山東重要的干果產品之一。自2004年以來，在山東泰安、濟南、濰坊、臨沂等幾個板栗產區相繼發生了一種新的葉部病害——板栗褐緣葉枯病(Phomopsis mollissima Y.Z.Hua＆S.X.Jiang)，該病的主要癥狀為板栗葉片上初期產生褐色斑點，隨后病斑迅速擴大，呈不規則大面積干枯。病葉9月中、下旬開始大量落葉，10月中、下旬二次發芽抽梢，新發枝梢冬季枯死，又極易誘發板栗疫病，引起林木整株死亡。近幾年來，該病發生面積逐年擴大，危害程度逐年加重，給各地板栗樹生長和產量均造成了不同程度的危害和損失。如泰安市徂徠山林場2005年十年生板栗樹死亡800余株，2006年死亡9000余株，減產近15×10kg。根據目前國內外發表的有關板栗葉斑病類的文獻，均沒有對該病害的報道。2007年開始，作者對其病原及生物學特性、發病規律及防治方法進行了系統的研究。本試驗對該病原菌的生物學特性進行了研究，以期為該病害的防治提供理論基礎與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：板栗褐緣葉枯病葉采自泰安市徂徠山林場光化寺林區。采帶有病斑的新鮮板栗葉片，在病斑的病健交界處進行組織分離。按柯赫氏法則進行致病性測定，經過對病原菌形態學和分子生物學鑒定后，單孢分離，保存于4℃冰箱中備用。

供試孢子：將病原菌菌餅接種到PSA板栗汁培養基上，在25℃恒溫條件下培養，12d左右在呈灰褐色菌落上開始產生載孢體，載孢體25℃條件下培養40 d左右產生成熟的甲、乙型分生孢子，在15～25℃變溫、散色光的條件下易破裂，釋放出成團的桔黃色黏稠狀溢出物，即甲型孢子，作為本次試驗所用孢子。

1.2 研究方法

1.2.1 不同培養基對菌絲生長的影響

選用PSA培養基(馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀5 g、清水1 000 m1)、PSA板栗汁培養基(馬鈴薯200 g、板栗汁5 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀5 g、清水1 000 ml)、燕麥培養基(燕麥30 g、瓊脂25 g、清水1000 ml)、燕麥馬鈴薯培養基(馬鈴薯200 g、燕麥30 g、硫酸鎂20 g、瓊脂20 g、蔗糖20 g、清水1 000 ml)、玉米培養基(玉米粉50 g、瓊脂10 g、清水1 000 m1)5種培養基，以清水瓊脂培養基為對照。將病原菌沿菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅移植到培養基平板中央，25℃恒溫培養，于接種后的第72、96、120 h用十字交叉法測量菌落直徑，并計算平均值。每個處理重復4次。

1.2.2 不同溫度對菌絲生長和孢子萌發的影響

將病原菌沿菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅移植到PSA板栗汁培養基平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35℃等7個不同溫度梯度下培養，于接種后120 h測量菌落直徑，每個處理重復4次。以pH 6的0.2％板栗汁配制孢子懸浮液(15×40倍視野鏡下10～20個孢子)，滴于凹玻片上，分別放置于10、15、20、25、30、35、40℃下進行培養，18 h后觀察其萌發率，每處理重復4次。

1.2.3 不同pH值對菌絲生長和孢子萌發的影響將板栗汁PSA培養基滅菌后用滅菌的NaOH和HCl分別調pH值至2、3、4、5、6、7、8、9，然后制成平板。接5 into的菌餅后，在25℃溫度下恒溫箱中培養，于接種后120 h測量菌落直徑，每個處理重復4次。配置0，2％板栗汁孢子液(10×40倍視野鏡下10~20個孢子)，以1 mol/L NaOH和HCI調節溶液，形成pH值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的梯度。用載玻片孢子萌發法，將孢子液滴于凹玻片上，放置在25％培養箱中，18 h后觀察其萌發率。每處理重復4次。

1.2.4 不同碳源對菌絲生長的影響基本培養基為PDA板栗汁培養基(馬鈴薯200 g、板栗汁5 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀5 g、水1000 ml)，以2％葡萄糖為碳源，分別以相同含碳量的蔗糖、木糖、果糖、淀粉、甘露醇、麥芽糖、甘油替換葡萄糖，配制成含有不同碳源的培養基。以清水瓊脂培養基為對照。從病原菌菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅，分別接種到上述不同碳源的培養基上，置于25℃下恒溫箱中培養，于接種后48、96 h測量菌落直徑，每個處理重復4次。

1.2.5 不同氮源對菌絲生長的影響基本培養基為PSA板栗汁培養基(馬鈴薯200 g、板栗葉5 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、硝酸鈉2 g、磷酸二氫鉀5 g、水1000 m1)，以硝酸鈉為氮源，分別以相同含氮量的蛋白胨、甘氨酸、氯化銨、硝酸鉀、酵母、天冬酰胺替代硝酸鈉，配制成含有不同氮源的培養基。其它方法同1.2.4。

1.2.6 不同營養成分對孢子萌發的影響

采用載玻片孢子萌發法，用0.5％板栗汁、0.2％蔗糖、0.2％葡萄糖、0.2％馬鈴薯汁及無菌水分別配制一定濃度(15×40倍視野鏡下10～20個孢子)的孢子懸浮液，各取一滴滴在凹玻片上，放置在25℃培養箱中培養18 h后觀察其萌發率，每處理重復4次。

1.2.7 不同濕度對孢子萌發的影響在干燥器內用不同濃度的硫酸調制成90％、85％、75％、65％、50％、25％、10％的相對濕度，將0.2％板栗汁孢子懸浮液(15×40倍視野鏡下10～20個孢子)滴于凹玻片上，分別放置于上述不同相對濕度的干燥器中，25℃恒溫培養，18 h后觀察其萌發率，每處理重復4次。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對菌絲生長的影響

試驗結果(圖1)表明，菌絲在PSA、PSA板栗汁和燕麥馬鈴薯培養基上生長120 h，平均直徑分別為88.0、85.3、85.1mm，三者差異不顯著。在PSA培養基上，菌絲較致密，菌落突起，呈白色絮狀，生長旺盛；其次是PSA板栗汁和燕麥馬鈴薯培養基。在玉米培養基上，雖菌絲擴展直徑小于前3種培養基，但菌絲致密，菌落厚而突起明顯。呈白色絮狀，生長健壯。菌絲生長最差的是在燕麥培養基上。

2.2 不同溫度對菌絲生長的影響

菌株在5～35℃范圍內都能生長，20～30℃生長最快，菌絲生長的最適溫度為25~C，低于10℃菌絲生長極差，高于35℃不生長，說明該菌適宜相對中溫環境。分生孢子在10～40℃均能萌發，適宜溫度為15～35℃，最適溫度為20～30℃，15℃以下35℃以上分生孢子的萌發率很低(圖2)。

2.3 不同pH值對菌絲生長和孢子萌發的影響

菌絲在pH值3～9均能生長，最適pH值5～6。分生孢子在pH值3～10的溶液中均可萌發，酸性條件有利于孢子萌發，pH值4～7分生孢子萌發率維持在較高水平，萌發最適pH值為5，當溶液變為堿性時(pH值8)，萌發率降低(圖3)。

2.4 不同碳源對菌絲生長的影響

在8種供試碳源中，該菌在甘露醇、麥芽糖、甘油、果糖、木糖、淀粉、葡萄糖上均生長良好，且差異不大，以葡萄糖為較優，在蔗糖中生長較差(圖4)。由此可見，該菌對碳源的適應性較強。

2.5 不同氮源對菌絲生長的影響

不同氮源對菌絲生長的影響有一定差別，最適氮源為氯化銨和甘氨酸，其次為酵母。菌絲在硝酸鉀、硝酸鈉、天冬酰胺、蛋白胨4種氮源中生長差異不顯著(圖5)。

2.6 不同營養成分對孢子萌發的影響

Beckman等(1983)報道，營養能抑制分生孢子的萌發和芽管的伸長。試驗表明，分生孢子在清水及4種營養液中均可以直接萌發，說明分生孢子萌發不需要營養，而葡萄糖對孢子萌發有抑制作用(圖6)。

2.7 不同濕度對孢子萌發的影響

在相對濕度(RH)85％時孢子萌發率最高，達到87.4％。相對濕度低于或高于85％，孢子萌發率均下降，低于50％時孢子不能萌發，在飽和濕度下孢子萌發率為67.3％(圖7)。

3 結論

通過對板栗褐緣葉枯病病原菌的生物學特性研究得出，病原菌對營養的要求不嚴格，在多種培養基上均能生長良好，以PSA、PSA板栗汁和燕麥馬鈴薯培養基最為適合；菌絲生長的適宜溫度為20～30℃，最適pH值為5～6；該菌對不同碳源和氮源利用率均較高，碳源以葡萄糖為較優，氮源以氯化銨和甘氨酸為最佳。

病原菌分生孢子萌發對營養的需求低。在清水及多種營養液中均可以直接萌發；分生孢子在10～40℃均能萌發，適宜溫度為15～35℃，最適溫度為20～30℃；在相對濕度85％時孢子萌發率最高，低于或高于85％，孢子萌發率均下降，相對濕度低于50％孢子不能萌發；酸性條件有利于孢子萌發，pH值4～7分生孢子萌發率維持在較高水平，萌發最適pH值為5。