瓊脂糖凝膠電泳檢測煙粉虱Q型與B型微衛星位點BEM23的研究

摘要：近年來煙粉虱Q型和B型在國內外許多地區混合發生并造成危害，2種生物型的快速鑒定對于煙粉虱有效防控具有重要的指導意義。在前期研究基礎上。使用瓊脂糖凝膠電泳對2005～2009年山東各地采集的煙粉虱樣品(139頭Q型煙粉虱、239頭B型煙粉虱)微衛星位點BEM23進行了檢測研究。結果表明，絕大多數Q型煙粉虱只擴增到約400 bp的片段(占98.6％)，而多數B型煙粉虱擴增到的片段約200 bp(占97.9％)。鑒于絕大多數Q型和B型煙粉虱分別只存在約400 bp和約200 bp產物片段。該方法可用于B型、Q型煙粉虱大量樣品生物型的初步篩選。

關鍵詞：煙粉虱；微衛星位點；生物型；瓊脂糖凝膠電泳；生物入侵

中圖分類號：Q503；Q969.36+6.6 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942(2010)04-0004-04

煙粉虱是一種分布廣泛的重要農業害蟲，可以傳播110多種植物病毒，對蔬菜、棉花及觀賞植物可造成嚴重危害。煙粉虱通常被視為包括許多生物型的復合種，迄今為止至少有30多個生物型。這些生物型在形態上難以區分，但在傳毒能力、寄主范圍、繁殖力、抗藥性、入侵性等方面存在差異。其中B型煙粉虱在20世紀90年代入侵到世界各地并暴發成災，而Q型煙粉虱近5年來也從地中海周邊國家入侵到包括中國、美國、韓國、日本在內的至少11個國家。煙粉虱在山東省分布廣泛，特別是在抗蟲棉上種群數量高于常規棉，對抗蟲棉生產形成威脅。近期研究發現，在我國許多地區Q型與B型混合發生并成為煙粉虱的優勢生物型。Q型煙粉虱對常用的新煙堿類、生長調節劑類殺蟲劑具有明顯抗性，而這些殺蟲劑能很好控制B型煙粉虱，因此，這兩種生物型的快速鑒別對于煙粉虱有效防控具有重要的指導意義。對煙粉虱生物型的鑒定通常使用各種分子標記，如隨機擴增多態性DNA(RAPDPCR)和擴增片段長度多態性(AFLP)、線粒體細胞色素氧化酶I(mt COI)、核糖體內轉錄間隔區I(ITSI)等。近年來，許多研究人員開發了能夠快速鑒別煙粉虱B型、Q型的分子標記，如序列特征擴增區(SCAR)和酶切擴增多態性序列(CAPS，又稱為PCR－RFLP)分子標記。

MeKenzie等(2009)L20J研究發現，微衛星位點BEM06和BEM23聯合使用能準確鑒定美國煙粉虱生物型。BEN06目的片段均在200 bp左右，而BEM23的目的片段在B型與Q型煙粉虱之間差異較大，B型只有224 bp的片段，而絕大多數Q型煙粉虱(99％Q1線粒體型、100％Q2線粒體型和95％Q3線粒體型)擴增得到407 bp或410 bp片段，只有1％Q1線粒體型有224 bp、5％Q3線粒體型有230 bp片段。我們進一步驗證也表明：在微衛星位點BEM23，Q型煙粉虱具有不同于B型煙粉虱的等位基因。

微衛星分析通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測，操作相對于瓊脂糖凝膠電泳較為煩瑣，而B型、Q型煙粉虱在BEN23位點存在的特異片段(之間相差約180 bp)可以利用瓊脂糖凝膠電泳來檢測，而且可以明顯區分，檢驗方法簡便。鑒于當前許多地區Q型煙粉虱占據主體，那么是否可以利用多數Q型煙粉虱個體在BEM23位點約400 bp片段的特點來對大量煙粉虱樣品進行初步篩選，然后對約200 bp片段個體進行進一步生物型鑒別?基于上述思路，我們對大量的B型與Q型煙粉虱微衛星BEM23位點進行了檢驗，以期對煙粉虱生物型的快速鑒定提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2005～2009年山東各地采集的煙粉虱樣品，浸泡在95％酒精中，于－20℃保存備用。實驗共使用煙粉虱樣品378頭，參考Khastan等和Ueda的方法利用Vsp I與Stu I為基礎的mtCOI－CAPS鑒定生物型，共139個Q型個體和239個B型個體(表1)。

1.2 微衛星BEM23位點擴增與檢測

單頭煙粉虱DNA的提取方法參照褚棟等的方法，最后加雙蒸水定容至50μl。PCR反應體系包括：2μl反應緩沖液，1 U Taq酶，0.2 mmol/LdNTPs，BEM23上下游引物各0.2 panol/L，模板DNA為4μl。在Eppendorf PCR儀上進行反應，條件為94℃預變性2 min；然后94℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 1 min，循環35次；最后72℃延伸5min。反應完成后取5μl產物用1％瓊脂糖檢測。

2 結果與分析

微衛星引物BEM23能對煙粉虱樣品進行有效擴增(見圖1)，經PCR擴增后，均可得到約400bp或約200 bp的片段(見表2)。絕大多數Q型煙粉虱只擴增到約400 bp的片段(占98.6％)，而多數B型煙粉虱擴增到的片段約200 bp(占97.9％)。0.7％的Q型煙粉虱可以擴增到約200bp的片段，0.4％的B型可以擴增到約400 bp的片段。另外，還有少部分的B型與Q型煙粉虱同時擴增到2條片段。

3 討論與結論

尋找一個簡便的適用于大量煙粉虱樣品生物型鑒定的方法對于煙粉虱防治及入侵生態學研究都有重要的意義。鑒于煙粉虱Q型與B型的較強入侵性及危害性，各國研究者開發了許多鑒別這2種生物型的快速分子標記。然而，這些分子標記由于世界各國2種生物型核基因或線粒體基因的遺傳變異，其有效性及使用范圍有待于進一步的驗證。

微衛星標記具有易于檢測的優點，如果可以使用一種微衛星標記來區分B、Q型煙粉虱則生物型鑒定將變得更加容易。根據McKenzie等(2009)[20l的研究結果，利用微衛星位點BEM23可以初步將多數Q型個體從B型、Q型煙粉虱混合種群中鑒別出來。本研究中，139個Q型煙粉虱樣品中，有137個在微衛星位點BEM23處只出現約400 bp的片段，這與McKenzie等(2009)的研究結果一致。但是與之不同的是，239個B型煙粉虱中也有1個B型煙粉虱個體也能擴增出約400 bp片段(僅擴增到約200 bp片段的有234個個體)。而且，少數B型、Q型煙粉虱在BEM23位點還可以擴增到約400 bp和約200 bp2條較弱目的片段。這可能與采集樣品不同有關，也可能是生物型間遺傳變異或生物型間雜交所導致的。

在田間調查或進行煙粉虱生物型監測預報等不需要精確數值的工作方面，微衛星標記方法比現有的其他方法顯示出較大優勢，例如費用少，方法簡單，易于操作，易于檢測，只需要瓊脂糖檢測即可。而且，B型煙粉虱出現約400 bp的幾率很低，15個種群239頭B型煙粉虱中只有1個特殊個體。樣品只擴增出約400 bp的情況下，99.3％(137/138)的個體是Q型煙粉虱，而B型的比例為0.7％。若只擴增約200 bp，則樣品為B型的可能性是99.6％。在實踐中，可以利用該方法初步鑒定生物型，然后再對特殊個體(出現2條帶的)用其他方法進行鑒定(如CAPS)，這樣會減少工作量或降低費用。同時，利用該方法鑒定生物型對DNA質量要求較低，我們實驗表明當用C1－J－2195/L2－N－3014擴增CO I失敗的情況下，可以用BEM23擴增從而鑒別B型與Q型煙粉虱。因此，應用微衛星位點BEM23在大批量篩選監測煙粉虱生物型動態以及室內研究生物型競爭取代等方面具有較好的應用價值。