松材線蟲伴生細(xì)菌與松樹萎蔫病關(guān)系的初步研究

摘要：利用3年生黑松苗作接種材料，分別接種消毒后的松材線蟲和從線蟲體內(nèi)分離得到的細(xì)菌分離物以及線蟲與細(xì)菌兩者的混合物，調(diào)查比較發(fā)病情況。結(jié)果表明，單獨(dú)接種消毒后的細(xì)菌分離物，松樹不萎蔫，單獨(dú)接種松材線蟲松樹發(fā)病枯死，而接種松材線蟲和細(xì)菌分離物兩者的混合物，松樹發(fā)病更為嚴(yán)重。由此說明松材線蟲的伴生細(xì)菌對松樹萎蔫病的發(fā)生有一定作用，但并不是導(dǎo)致松樹發(fā)病枯死的決定因素。

關(guān)鍵詞：黑松；松材線蟲；伴生細(xì)菌；松樹萎蔫病

中圖分類號：S763.712.56 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001－4942(2010)04－0059－03

松樹萎蔫病又稱松材線蟲病，是松樹的一種毀滅性傳染病，對我國松林資源、自然景觀和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破懷。本試驗(yàn)以3年生黑松為接種材料，以2個地理種即浙江松材線蟲Bxzh和葡萄牙松材線蟲Bxpo以及分離獲得的兩個細(xì)菌分離物Bzh和Bpo為材料，通過接種實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步研究，以期明確松材線蟲攜帶的細(xì)菌和松樹萎蔫病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樹種為3年生黑松(Pinwus thunbergii)。

供試松材線蟲為浙江松材線蟲Bxzh和葡萄牙松材線蟲Bxpo，分別來自浙江和葡萄牙。采用單異活體培養(yǎng)法將消毒的線蟲接種于生長在PDA培養(yǎng)基上的灰葡萄孢(Bort，yis cinerea)上25℃培養(yǎng)繁殖。接種前，線蟲先經(jīng)0.5％硫柳汞消毒15～20 min，再經(jīng)0.5％硫酸鏈霉素消毒15～20 min，最后用無菌水洗3次，移入Eppendorf管中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

供試細(xì)菌，將含有少量松材線蟲的水懸液經(jīng)0.1％硫酸鏈霉素消毒15～20 min，無菌水洗3次后，于NA培養(yǎng)基(牛肉浸膏0.5％，K2HPO40.5％，瓊脂1.5％，pH值為7.0)上25℃下倒置培養(yǎng)。1～2 d后，將長出細(xì)菌的培養(yǎng)基放于無菌操作臺內(nèi)進(jìn)行純化，從浙江松材線蟲Bxzh和葡萄牙松材線蟲Bxpo中分別得到細(xì)菌分離物Bzh和Bpo，將其加入到NB培養(yǎng)基(NA中不加瓊脂)中。27℃、170 r/rain振蕩條件下暗培養(yǎng)2 d，平板稀釋計數(shù)后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 接種

采用皮接法。用鋒利的刀片在黑松苗基部離地面約5 em處斜切一深達(dá)木質(zhì)部的傷口，然后塞入一塊脫脂棉，并用膠布纏緊，上端留一縫隙以便接種。共設(shè)9個處理：①線蟲：接種消毒后的浙江線蟲Bxzh和葡萄牙線蟲Bxpo，均為5 000條/株。②細(xì)菌：接種細(xì)菌分離物Bzh和Bpo，均為3×10CFU/株。③線蟲+細(xì)菌：每株接種消毒后的松材線蟲5 000條及其對應(yīng)的細(xì)菌分離物3×10CFU。④陽性對照：接種未消毒的線蟲，均為5 000條/株。⑤無菌水陰性對照。每個處理重復(fù)4次。

1.3 病情觀察

從接種后開始觀察，記載松樹發(fā)病情況。每隔5 d觀察1次，記錄發(fā)病級數(shù)。松苗的病情分級和感病指數(shù)的計算按談家金等(2000)的方法進(jìn)行。樹苗死后，去掉樹皮和針葉，分離收集線蟲計數(shù)并采用Brassh等(1999)提出的方法計算相關(guān)寄主適應(yīng)性(Relative Host Suitability，RHS)系數(shù)。

發(fā)病級數(shù)，根據(jù)針葉褪綠枯黃和變紅的程度分為5級。0級為針葉正常；I級為部分褪綠1/4針葉變黃；Ⅱ級為2/4～3/4針葉變黃、1/4以下針葉變紅；III級為3/4左右針葉變紅；IV級為針葉全變紅瀕臨死亡或死亡。

感病指數(shù)(IP)=∑(發(fā)病株數(shù)×代表級數(shù))/(處理株數(shù)×最高病級代表值)

RHS系數(shù)=(接種后松苗死亡百分?jǐn)?shù)×每株死亡松苗分離線蟲的平均數(shù))/1000

2 結(jié)果與分析

2.1 感病進(jìn)程分析

由表1看出，單獨(dú)接種細(xì)菌分離物Bzh、Bpo及無菌水對照在不同接種時期不發(fā)病或發(fā)病較輕；除個別時期外，Bxzh、Bxzh+Bzh、Bxzh CK+3個處理在相同時期發(fā)病逐漸加重，同處理隨接種時間延長其發(fā)病總體呈愈加嚴(yán)重趨勢。Bxpo、Bx－p0+Bpo、Bpo CK+3個處理的發(fā)病規(guī)律同上。

2.2 接種后的黑松樹苗死亡率

由表2可知，接種葡萄牙線蟲分離細(xì)菌、浙江線蟲分離細(xì)菌和無菌水的處理，松樹未死亡，而線蟲分離其它處理的松枝全部死亡?？梢酝茢?，單獨(dú)接種細(xì)菌不能使黑松樹苗致死，只有接種了松材線蟲或者同時接種了線蟲+細(xì)菌才能導(dǎo)致黑松樹苗萎蔫枯死。

2.3 各處理的RHS系數(shù)

由表3可知，分離葡萄牙線蟲的RHS系數(shù)，處理Bxzh CK+>Bxzh+Bzh>Bxzh；分離浙江線蟲的RHS系數(shù)變化趨勢同葡萄牙線蟲；處理Bzh、Bpo、CK一未分離得到線蟲，RHS系數(shù)為0。RHS系數(shù)可以顯示黑松對不同線蟲群體的適應(yīng)能力，也可顯示不同群體的致病力?？芍魈幚淼腞HS系數(shù)越大，該處理的致病力也越強(qiáng)。

3 小結(jié)與討論

綜上所述，由致死率知，單獨(dú)接種松材線蟲的伴生細(xì)菌不能使黑松枯萎死亡，而單獨(dú)接種線蟲或同時接種線蟲及其伴生細(xì)菌的混合物可導(dǎo)致黑松發(fā)病致死；由感病指數(shù)和RHs系數(shù)知，伴生細(xì)菌可加重黑松感病，這一點(diǎn)與國內(nèi)外的報道有所不同。

可見，松材線蟲本身對松樹的萎蔫起到極其重要的作用，不僅是其伴生菌的載體，其在樹體中的繁殖移動很可能對樹體造成了破壞，從而導(dǎo)致樹勢下降。如果在此時遇到高溫干旱等逆境脅迫，松樹死亡會更高。

用無菌線蟲接種的松苗發(fā)病速率明顯減慢。最終分離到的線蟲數(shù)少于原接種量。對這一現(xiàn)象的可能解釋是：(1)松材線蟲的所謂伴生細(xì)菌在線蟲的生活力上有極其重要的作用；(2)在消毒過程中，鏈霉素或硫柳汞對線蟲的生活力造成了一定的影響，從而使得線蟲的繁殖力下降。

伴生細(xì)菌使感病加重，也同樣證明了伴生細(xì)菌對松材線蟲為害的促進(jìn)作用，其原因還有待于進(jìn)一步研究。單獨(dú)接種伴生細(xì)菌并不能使松樹萎蔫枯死，也說明伴生細(xì)菌并不是導(dǎo)致松樹發(fā)病枯死的決定因素。