羊流產衣原體的ＰＣＲ檢測方法研究

張　莉　王英珍　鄢明華　李秀麗

摘要:根據羊流產衣原體16S rRNA基因保守序列,設計合成一對引物,通過優化PCR反應條件,成功地擴增出預期的523 bp片段,而沙眼衣原體、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及健康雞胚的卵黃囊膜均未擴增出相應的片段。敏感性試驗表明,該體系可檢測到2 pg的衣原體DNA。

關鍵詞:羊流產衣原體;PCR;檢測

中圖分類號:S852.67文獻標識碼:A文章編號:1006-6500(2009)02-0014-03

Research on the PCR Method to Detect Ovine Chlamydia abortus

ZHANG Li,WANG Ying-zhen,YAN Ming-hua,LI Xiu-li

(Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Tianjin 300112,China)

Abstract:A PCR based detection method was developed using a pair of primers designed from a conserved region of the Chlamydia abortus 16S rRNA gene.This method used all optimized PCR conditions to detect the presence of Chlamydia abortus sequence.A 523 bp fragment was amplified from infected sample,but not from Salmonella, E. coli, Staphylococcus aureus and the yolk sac membrane of health chick embryo.The sensitivity was 2 pg to detect the DNA.

Key words: Chlamydia abortus;PCR;detection

羊流產衣原體病是由流產衣原體(Chlamydia abortus)感染引起的一種以羊大量流產為特征的地方性、亞急性傳染病,其癥狀主要表現為羊的流產和肺炎,羔羊的多發性關節炎等[1,2]。人們對衣原體的研究始于19世紀末,自1950年Stamp等首次報道羊感染流產衣原體發生流產后,相繼在世界的多個國家都有了羊流產衣原體病的報道。衣原體是人獸共患病病原體,國內外許多學者都從人體分離到了動物源衣原體,人與患病動物接觸可患病(呼吸感染),孕婦感染流產衣原體后發生流產[3]。因此,對衣原體的研究具有重要的公共衛生意義。

國內外學者對衣原體檢測技術進行了許多探討,例如ELISA和間接血凝試驗等[4,5]。隨著人們對衣原體基因組研究的深入,分子診斷技術逐漸應用于衣原體病的快速診斷,并因其高的特異性、敏感性和準確性,被研究者所認同。筆者根據羊流產衣原體16S rRNA 基因的保守序列設計并合成引物,以建立用于該病的PCR 診斷技術。

1材料和方法

1.1材 料

羊流產衣原體ZT1株由本實驗室分離和保存;沙眼衣原體、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌購自中國獸藥監察所;羊鸚鵡熱衣原體油乳劑滅活疫苗購自中國農科院蘭州獸醫研究所;布氏桿菌病活疫苗(S2株) 購自黑龍江省生物制品一廠;Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer購自大連寶生物技術有限公司;引物由Invitrogen公司合成。

1.2方 法

1.2.1衣原體菌株的增殖將衣原體接種6日齡的SPF雞胚卵黃囊,37 ℃溫箱培養4～10 d,收獲死亡雞胚的卵黃膜凍存于-20 ℃備用[6]。

1.2.2引物根據羊流產衣原體的16S rRNA基因的保守序列設計合成一對引物。序列為:

ChU1:5' -CCCCAAGCCAGCATCTAATA3'

ChL1:5' -CCCAGGCAGTCTCGTTAGAG 3'

1.2.3DNA的提取將收獲的衣原體培養物加入PBS研磨成懸液,4 000 r/min離心10 min取上清445 μL,加入12.5 μL蛋白酶K(20 mg/mL)和25 μL10%SDS,56 ℃水浴2 h,苯酚、苯酚:氯仿、氯仿分別抽提一次,吸取水相,加入2倍體積的無水乙醇后在-20 ℃沉淀1 h,10 000 r/min離心10 min,沉淀經70%乙醇洗滌,干燥后溶于20 μL TE 中,-20 ℃凍存備用。DNA濃度測定采用分光光度計法。

1.2.4PCR 擴增體系采用50 μL PCR 反應體系:20 μmol/L 引物ChU1和ChL1各1 μL,10×PCR Buffer (含500 mmol/L KCl,100 mmol/L Tris-HCl,1% TritonX-100 和15 mmol/L MgCl₂ )5 μL,25 mmol/L dNTPs 4 μL,Taq DNA聚合酶0.5 μL,DNA模板2 μL,去離子水36.5 μL。

擴增程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s,55～65 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果。

1.2.5PCR最佳反應體系的優化除以下優化的反應條件外,均按1.2.4所述條件進行。

(1)引物濃度的選擇設定20,30,40 μmol/L 3個濃度梯度,每個梯度設置3個重復。

(2)dNTPs最佳濃度的選擇設定dNTP的濃度為25,50,100,150 ,200 mmol/L 5個梯度。

(3)復性溫度的選擇選擇55,56,57,58,59,60,61 ℃的復性溫度進行PCR擴增,確定最適反應溫度。

1.2.6PCR 特異性試驗分別取羊鸚鵡熱衣原體分離株ZT1、羊鸚鵡熱衣原體疫苗株、布氏桿菌疫苗株、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及健康雞胚的卵黃囊膜的DNA進行PCR擴增,并設立水對照,凝膠電泳觀察結果。

1.2.7PCR 敏感性試驗提取的衣原體DNA采用分光光度計法進行濃度測定,并稀釋至0.1pg、1pg、10pg和100pg倍,分別取2 μL作為模板進行PCR。以出現陽性反應條帶的最低DNA濃度,推算可檢出的最低DNA含量。

1.2.8重復性試驗取3份不同代次的衣原體樣品進行重復性檢測。

1.2.9PCR產物的鑒定將PCR擴增產物送大連寶生物公司測序。

2結果與分析

2.1PCR最佳反應體系的優化

2.1.1引物濃度的選擇 采用20,30,40 μmol/L 3個濃度進行擴增,結果20 μmol/L和30 μmol/L雖能擴增出預期產物,但引物二聚體明顯,而40 μmol/L時,擴增條帶清晰,且沒有引物二聚體。因此,選擇40 μmol/L為最佳引物濃度。

2.1.2dNTPs最佳濃度的選擇分別以25,50,100,150,200 mmol/L 5個濃度進行擴增,結果顯示,100 mmol/L以上均可擴增出明顯的特異性條帶,基于成本的考慮,選擇100 mmol/L為最佳dNTPs濃度。

2.1.3復性溫度的選擇選擇55,56,57,58,59,60,61℃ 7個復性溫度進行擴增,結果如圖1,7個溫度均能擴增出特異性條帶,但61 ℃擴增條帶最亮,且引物二聚體最不明顯,為最佳復性溫度。

2.2PCR 特異性試驗

將提取的羊流產衣原體、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及健康雞胚的卵黃囊膜的DNA進行PCR擴增,結果顯示,只有羊流產衣原體菌株能夠擴增出預期大小的PCR產物(圖2)。經測序鑒定,擴增產物與預期產物的序列完全一致,進一步說明了PCR反應的特異性。

2.3PCR 敏感性試驗

取不同稀釋度的羊流產衣原體DNA 進行PCR擴增,結果顯示,2 pg的DNA作為模板可以擴增出特異性條帶,說明該PCR方法最低可檢出2 pg的衣原體DNA(圖3)。

2.4重復性試驗

取3份不同代次的衣原體樣品進行重復性檢測,結果一致,均可擴增出特異性條帶。

3討 論

(1) PCR擴增的特異性與引物有很大關系,引物設計不合理,則會增加非特異性反應。本研究設計的引物對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、布氏桿菌這幾種陰道分泌物中較多的細菌及健康雞胚的卵黃囊膜的DNA進行PCR擴增,結果均為陰性,只有羊流產衣原體擴增出了特異性的條帶。證明了所設計引物的可靠性和特異性。

(2) dNTPs的濃度與PCR產物量密切相關。當dNTPs濃度太高時,會抑制Taq DNA聚臺酶的活性;當dNTPs濃度太低時,PCR產物量低。本研究通過設計不同的dNTPs濃度進行PCR 結果對比,認為100 mmol/L為最佳濃度。

(3)在PCR反應的溫度循環參數中,復性溫度對不同的PCR反應體系而言差異較大,復性溫度的選擇直接與引物的序列組成有關。本試驗應用梯度PCR儀,設定了不同的溫度,比較PCR結果,認為61 ℃為最適復性溫度。

PCR具有敏感性高、特異性好和快速簡便的優點,在羊流產衣原體病上的應用有待于更多學者的深入研究。

參考文獻:

[1] 張莉.羊衣原體病診斷方法的研究進展[J].豬業科學,2006(增刊):25-27.

[2] 臧洪波,徐麗穎.鸚鵡熱衣原體導致羊繁殖障礙疾病[J]. 黑龍江動物繁殖,2003,11(1):34-35.

[3] Pospischil A, Thoma R, Hilbe M, et al. Abortion in woman caused by caprine Chlamydophila abortus (Chlamydia psittaci serovar 1) [J]. SWISS MED WKLY, 2002, 132:64-66.

[4] 王英珍,鄢明華,李秀麗,等.河南省部分地區山羊衣原體病血清學檢測[J].動物醫學進展,2004,25(5):133.

[5] 姚四新,宋東亮,任曉麗,等.豬羊衣原體病的血清學調查[J].今日畜牧獸醫,2007(3):56.

[6] 王英珍,張莉,李秀麗,等.羊衣原體性流產的病原分離培養與鑒定[J].中國獸醫科技,2004(增刊):13-15.