一種改進的胡蘿卜染色體制片方法

陳　磊　管長志　尹立榮　霍文娟　趙　恒

摘要:以胡蘿卜根尖作為試驗材料,對常規胡蘿卜染色體制片方法進行了改良,結果表明:經改良后的制片方法在質量和獲得所需細胞數量上都有明顯的提高。

關鍵詞:胡蘿卜;染色體制片;改良

中圖分類號:S631.2文獻標識碼:A文章編號:1006-6500(2009)02-0012-02

An Improved Method for the Observation of Chromosome in Carrot

CHEN Lei1, GUAN Chang-zhi1, YIN Li-rong1,HUO Wen-juan2,ZHAO Heng2

(1.Tianjin Research Center of Agriculture Biotechnology,Tianjin 300192,China;2.Tianjin Academy of Agricultural Sciences.Tianjin300192,China)

Abstract:With the root tips of carrot as examination material, one improvedmethod wasusedfor observation of chromosome in carrot, the result indicated that the well-spread and clear mitotic metaphase chromosomes of carrot were obtained after the improvement. And the more aim cell which needed than the general methodalso be obtained.

Key words: carrot; observation of chromosome; improvement

細胞分類學是應用細胞學的特征和性狀,如染色體的形態、數目尋求他們與分類等級之間的關系,探索種群的發育和演化,從而為植物類群的變異和起源獲得更廣泛、更有根據的資料。核型分析作為植物學分類及遺傳研究的一個重要手段,可以使學者們在研究有爭議的植物時有更多的參考資料,以達到意見上的統一。

染色體制片是顯示染色體形態和結構的技術。目前,常用的胡蘿卜染色體觀察方法為醋酸地衣紅染色法和去壁低滲火焰干燥法。筆者通過實踐得知,前者雖然操作簡便,但不易獲得良好的壓片,而后者試驗條件苛刻,過程繁瑣。改良后的制片方法克服了以上兩種方法的缺點,不僅方法簡便,還可獲得良好的壓片。

1材料和方法

1.1取材

1.1.1材料把籽粒飽滿的胡蘿卜種子放在墊有濾紙的培養皿中,置于25 ℃恒溫箱內,待根長至1～2 cm時可作為供試材料。

1.1.2取材方法一般取材時間為下午2點,預處理方式為活體。

1.1.3材料處理將根尖在解剖鏡下用解剖針對其表面做輕微劃傷處理,處理后在蒸餾水中浸泡活化5 min。

1.2染色體制片

1.2.1預處理將活化后的材料放入飽和的對二氯苯飽和溶液中,靜置2～2.5 h,反復沖洗3次后,置于卡諾氏固定液中進行固定,時間為20～24 h,然后反復沖洗3次。

1.2.2解離將固定后的材料放入1 mol/L的HCL溶液中,在60 ℃水浴鍋中解離6 min后,反復沖洗3次。

1.2.3染色前處理在解剖鏡下,將解離后的材料的根冠用解剖針剝離,并切下根冠初0.3～0.6 cm,作為最終制片材料。

1.2.4染色將材料置于載玻片上,用濾紙吸去材料周圍多余的水分,加1～2滴卡寶染色液,同時用鑷柄敲擊材料1 min,盡量將材料敲碎。

1.2.5制片 將蓋玻片輕輕放下,用濾紙反復吸取蓋玻片四周多余的染液,然后將其在酒精燈上微微加熱4～5 s,加熱后將干凈的濾紙覆于其上,用玻棒沿蓋片對角線來回搟動,注意用力均勻,即完成制片。

1.2.6觀察將制好的片子先用顯微鏡的低倍物鏡找到材料和細胞分裂項,然后再轉入油鏡,就可以觀察到染色體了。

2結果與分析

該胡蘿卜染色體制片方法與常規方法相比的改良之處如下,染色體制片如圖1示。

(1)取材時在解剖鏡下將材料進行劃傷處理,并用蒸餾水進行活化。這樣的處理有助于對二氯苯更多地進入到被處理材料中,可以使細胞停留在分裂中期的相對較多,染色體在壓片時容易分散,縮短適中,縊痕清晰。

(2) 解離后在解剖鏡下用解剖針將材料打碎,并將根冠剝除。這樣的操作有利于染色液進入細胞,提高染色效果。

(3)染色時用鑷柄混合卡寶染色液將材料打碎,這樣可以更好地分散分生組織細胞,制得質量優良的染色體玻片。在酒精燈上微微加熱數秒可以破壞細胞質,增進染色效果。摒棄常規方法中用手指壓片后再用解剖針敲擊的方法,而采用隔著濾紙用玻棒來回搟,這兩個措施可以讓染色體分散并處于同一平面上,減少重疊,這對于胡蘿卜等染色體比較小的植物進行核型分析是特別有效的。

3 結論

植物染色體的長短范圍在0.5～30 μm之間,而胡蘿卜染色體較小,一般平均長度小于2.5 μm,因此,在制片中需要盡量做到染色體分散,減少重疊,染色清晰。經改良后的制片方法不僅可以解決上述問題,還可以明顯提高目的細胞獲得率。經統計,細胞獲得率大約是常規方法的2～5倍。同時,試驗材料的選擇也至關重要,好的試驗材料分裂系數高,容易制得目標細胞數目高的染色體玻片。

胡蘿卜是一個較復雜的品種,包括栽培胡蘿卜亞種在內,一共有15個亞種。目前,栽培胡蘿卜品種主要為桔紅系列,其基因庫十分狹窄,且國內外對胡蘿卜染色體核型研究的報道較少,細胞遺傳學研究極為薄弱。因此,本試驗結果為胡蘿卜的核型分析以及深入開展種內雜交、種間雜交以及漸滲雜交提供必要的細胞遺傳學基礎。

參考文獻:

[1] 李懋學,張教方. 植物染色體研究技術[M].哈爾濱:東北林業大學出版社,1991.

[2] 李懋學,張贊平. 作物染色體及其研究技術[M]. 北京:中國農業出版社,1996.

[3] 張水乒,莊飛云,趙志偉,等.胡蘿卜有絲分裂核型及減數分裂觀察[J]. 上海農業學報,2005,21(3):26-28.

[4] Kynar P, Widholm J M. Techniques for chromosome analysis of carrot culture cells[J]. Plant Mol Bio Rep,1984(2):37-42.

[5] 陳瑞陽,宋文芹,李秀蘭,等,中國主要經濟植物基因組染色體圖譜[M]. 北京:科學出版社,2003:541-542.

[6] 韓毅科,杜勝利,王鳴.黃瓜染色體制片及倍性研究[J]. 華北農學報,2003(1):72-74.

[7] 楊佩茹,王瑞環,張君明,等.鑒定染色體的新型染色劑與復合染色制片新技術 [J]. 華北農學報,1991,6(3):61-64.