麻蠅全蛋白分析及凝集素的純化與鑒定

摘要以麻蠅成蟲(chóng)為材料，利用溶解度的不同，分別用硫酸銨、氯化鈉、乙醇、氫氧化鈉從脫脂麻蠅粉中分離、純化獲得清蛋白、小分子肽、球蛋白、醇溶蛋白和堿溶性蛋白等幾類蛋白。測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并用親和層析法純化凝集素，通過(guò)SDS—PAGE凝膠電泳測(cè)定各類蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。結(jié)果表明:脫脂麻蠅粉蛋白質(zhì)的主要成分是清蛋白、球蛋白和小分子肽;蛋白質(zhì)得率為44.94%，回收率為85.6%，凝集素的相對(duì)分子質(zhì)量為82.9KD，血凝活力效價(jià)為1/104。

關(guān)鍵詞麻蠅全蛋白凝集素

中圖分類號(hào):Q96文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

麻蠅是雙翅目麻蠅科昆蟲(chóng)。據(jù)國(guó)內(nèi)外對(duì)蠅蛆營(yíng)養(yǎng)成分的分析顯示，蠅蛆含粗蛋白59%～65%，超過(guò)糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)與世界衛(wèi)生組織(WHO)提出的參考值(40%);其必需氨基酸與非必需氨基酸總量的比值(E/N)為0.78，超過(guò)FAO與WHO提出的參考值(0.6)，還含有10%-16%的脂肪，8%-10%的甲殼素和多種維生素、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，是一種重要的飼料蛋白資源。VanderKnaap等人認(rèn)為凝集素能夠結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁上的糖鏈結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)胞破壁，達(dá)到殺滅細(xì)菌細(xì)胞的作用。而且蠅蛆中的抗菌物質(zhì)等活性蛋白質(zhì)還有不同的重要藥用價(jià)值。

目前，在昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的提取制備方面，對(duì)蠶蛹、家蠅進(jìn)行了一些研究，而麻蠅的全蛋白分析則很少，為此，本研究對(duì)麻蠅成蟲(chóng)蛋白質(zhì)的提取制備方法和工藝參數(shù)等進(jìn)行研究，并對(duì)麻蠅全蛋白分析及凝集素的純化與鑒定，目的是為更進(jìn)一步地規(guī)模化開(kāi)發(fā)和利用蠅蛆打下基礎(chǔ)，也對(duì)其它昆蟲(chóng)的蛋白質(zhì)分析起到一定的借鑒作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

麻蠅的成蟲(chóng)(江西思達(dá)生物技術(shù)有限公司提供);兔血取自新西蘭大白兔(南昌大學(xué)動(dòng)物研究所提供)。試劑:標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，瓊脂糖凝膠-4B，牛血清白蛋白，丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、甘氨酸、硫酸銨等。儀器:索式提取器，紫外分光光度計(jì)，垂直板電泳儀，高速離心機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麻蠅成蟲(chóng)的處理

(1)將成蟲(chóng)烘干，并粉碎成粉末狀(過(guò)180目篩)。(2)索氏脂肪抽提法浸提麻蠅油脂:用濾紙將4g粉末分批包好，放入索式提取器內(nèi)用石油醚抽提脂肪。4h后，脂肪已提取完全，并將抽提后的蠅粉烘干、冷卻、稱重、計(jì)算。抽脂后的麻蠅粉待用。(3)取1.2g抽脂后的麻蠅粉，加入20ml緩沖液攪拌均勻，在4℃下提取10h，用勻漿器勻漿后，再12000r/min離心15min，得上清液及剩余物，將剩余物重復(fù)上述操作。合并兩上清液，得上清液26ml。取0.5ml上清液，用Bradford檢測(cè)法測(cè)其蛋白質(zhì)含量(所制作標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1)。其余上清液和剩余物備用。

1.2.2 麻蠅成蟲(chóng)各蛋白組分的制備及其含量測(cè)定

(1)清蛋白和小分子肽(硫酸銨沉淀)。取25ml上清液，以鹽析溫度、pH值、硫酸銨濃度和時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，采用L25(54)正交法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(表1)，以所得蛋白含量為指標(biāo)，確定最佳工藝參數(shù)。

按表2加入硫酸銨至所需濃度，調(diào)pH值，在一定溫度條件下鹽析一定時(shí)間，離心，沉淀即為清蛋白，上清用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮得小分子肽，測(cè)其蛋白含量。

(2)球蛋白。在經(jīng)過(guò)蒸餾水提取后的剩余物中加入10%的氯化鈉攪拌，靜置，離心，取上清液，重提3次合并上清液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，測(cè)其蛋白含量。

(3)醇溶蛋白、堿溶蛋白和難溶蛋白。在經(jīng)過(guò)氯化鈉提取后的剩余物中依次加無(wú)水乙醇，2%的NaOH，提取和測(cè)定方法同(2)，分別提取醇溶蛋白、堿溶蛋白和難溶蛋白，并分別測(cè)定其含量。所得殘?jiān)娓煞Q重。

上述所得蛋白全部用葡聚糖凝膠G-10過(guò)濾后放入透析袋中，用聚乙二醇6000濃縮到適當(dāng)濃度備用。

1.2.3 麻蠅凝集素的純化

(1)凝集素的純化方法。取約10g新鮮成蟲(chóng)加入昆蟲(chóng)緩沖溶液(BIS)和少量的苯硫脲充分研磨，于4℃離心，重復(fù)3次，除去上層漂浮的脂肪層，保留上清液。將上清液與Sepharose-4B混合3h后裝柱，用BIS以1ml/min的流量洗脫雜蛋白，至280nm吸光度小于0.02時(shí)停止，用0.2mol/L的D-半乳糖解吸，流量為1ml/min，收集吸收峰，并將層析后的溶液裝入透析袋中透析，脫鹽后凍干，得淡黃色凝集素，備用。

(2)血凝活力(HA)的測(cè)定。在V形血凝板上，用PBS緩沖液0.5ml對(duì)己純化的麻蠅凝集素0.5ml進(jìn)行倍比稀釋，每管分別加入2%血球懸液0.5ml，振蕩1min，在室溫靜置1h，顯微鏡觀察凝血現(xiàn)象，測(cè)定其效價(jià)。效價(jià)定義為:最后一個(gè)發(fā)生可見(jiàn)凝集反應(yīng)的樣品稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。

1.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳鑒定麻蠅成蟲(chóng)各蛋白組分和凝集素。

電泳實(shí)驗(yàn)步驟:取適量上述所制取各蛋白組分和凝集素，參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》進(jìn)行。其中分離膠濃度為15%，堆積膠濃度為5%，開(kāi)始電壓80V，進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)至160V，至溴酚藍(lán)距離凝膠底部1cm時(shí)停止，用R-250染色。電泳圖譜見(jiàn)圖2。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨沉淀最佳工藝參數(shù)的篩選

由正交實(shí)驗(yàn)(表2)可知，硫酸銨濃度對(duì)麻蠅成蟲(chóng)鹽析所得蛋白量影響最大，其它條件依次為pH值、溫度、時(shí)間，因此因素主次關(guān)系為C>B>A>D。而且溫度、pH值、硫酸銨濃度、時(shí)間的最大均值分別為均值1、均值1、均值3、均值4。因此，鹽析的最優(yōu)組合為A1B1C3D4，即麻蠅成蟲(chóng)蛋白提取工藝的參數(shù)以溫度4℃、pH4、硫酸銨濃度70%、時(shí)間7h所提取的蛋白得率最高。

2.2 蠅蛆蛋白各組分含量的分析

根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的性質(zhì)，可將麻蠅成蟲(chóng)蛋白分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、堿溶蛋白和難溶蛋白。各蛋白組分的分布情況見(jiàn)表3。由表3可知，脫脂成蟲(chóng)粉中的蛋白質(zhì)以清蛋白、小分子肽、和球蛋白為主。脫脂成蟲(chóng)粉中的蛋白含量為52.5%，而提取出的各類蛋白總量為44.94%，脂肪含量為12.75%，可見(jiàn)利用溶解度不同的方法從脫脂麻蠅成蟲(chóng)粉中提取蛋白的提取率可達(dá)到85.6%。

2.3 麻蠅成蟲(chóng)各蛋白組分和凝集素的分析

圖2中從右到左分別為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)量、凝集素、醇溶蛋白、堿溶蛋白、難溶蛋白、球蛋白、清蛋白和小分子肽的電泳圖。由圖2可以看出，本試驗(yàn)所得麻蠅成蟲(chóng)主要蛋白的分子量為84KD，還有少部分蛋白質(zhì)的分子量為32-66.2KD。凝集素由三個(gè)亞基組成，分子量分別為34.9KD、29.4KD、18.6KD，血凝活力的效價(jià)為1/104。

3 討論

本研究所得麻蠅成蟲(chóng)的脂肪含量為12.75%，脫脂粉的蛋白含量為52.5%，提取的蛋白含量為44.94%，利用溶解度不同和鹽析的方法從脫脂麻蠅成蟲(chóng)粉中提取蛋白的提取率為85.6%，比王芙蓉的提取率低5.11個(gè)百分點(diǎn)，得率的差異可能與蠅蛆的品種有關(guān)，也可能是所用的方法不同。

以硫酸銨作為蛋白質(zhì)鹽析的中性鹽，用L25(54)正交實(shí)驗(yàn)確定出鹽析最佳參數(shù)為:溫度4℃、pH4、硫酸銨濃度70%、時(shí)間7h，獲得了較高的得率。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定麻蠅成蟲(chóng)主要蛋白的分子量為84KD，還有少部分蛋白質(zhì)的分子量為32-66.2KD。凝集素由三個(gè)亞基組成，分子量分別為34.9KD，29.4KD，18.6KD，其血凝活力的效價(jià)為1/104。