水飛薊賓琥珀酸單酯的合成及其保肝活性研究

朱　琳　李金柱　卞惠敏　秦　凱　李　偉

（南京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210029）お

摘 要：將水飛薊賓進(jìn)行衍生化，制備水溶性衍生物。水飛薊賓與丁二酸酐在堿性條件下反應(yīng)，生成水飛薊賓-3,23-二琥珀酸單酯和水飛薊賓-3-琥珀酸單酯，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV、IR、1H-NMR和MS波譜確證。在本反應(yīng)條件下，可以選擇性地對水飛薊賓分子中的醇羥基進(jìn)行酯化，制得水溶性好的衍生物。對產(chǎn)物進(jìn)行抗急性干損傷的研究，產(chǎn)物可降低ALT活性，對CCl4致小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：水飛薊賓；水飛薊賓-3,23-二琥珀酸單酯；水飛薊賓-3-琥珀酸單酯；保肝活性

中圖分類號：R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1673-2197（2009）01-0046-03オ

水飛薊賓是水飛薊素中的主要成分(占60%～70%)和重要的有效成分^[1]，在臨床上作為肝保護(hù)劑而被廣泛使用^[2]。但由于其溶解性太差，幾乎不溶于水和油脂，口服吸收差，生物利用度低，從而影響了其臨床療效^[3]。

水飛薊賓的結(jié)構(gòu)(圖1)最早由Pelte和Hansel在1975年通過降解的方法確定^[4]，對水飛薊賓的衍生物制備研究開展的很廣泛，主要的目的都是改善水飛薊賓的藥代動力學(xué)特征，增大其水溶性以改善其吸收。

本文的目的是對水飛薊賓3,23-位進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到具有羧基的衍生物，以便將其制成水中溶解度較好的鈉鹽，實(shí)現(xiàn)注射給藥。

1 合成部分

1.1 儀器與試劑

Waters2690高效液相色譜儀；BUCHI B-450型熔點(diǎn)測定儀；Bruker AV-500型核磁共振儀；水飛薊賓，遼寧盤錦格林恩生物資源開發(fā)有限公司；其它試劑均為分析純，南京化學(xué)試劑有限公司。お

1.2 合成路線

1.3 合成方法

在50mL圓底燒瓶中加入丁二酸酐0.3g(3mmol)、氫氧化鈉0.04g(1mmol)、四氫呋喃30mL，室溫攪拌1h后，加入水飛薊賓0.24g(0.5mmol)，繼續(xù)室溫攪拌3h，硅膠拌樣，揮干溶劑后，低溫干燥，用硅膠(100～200目)柱層析分離純化，以CH₂Cl₂-CH₃OH(80∶1～40∶1)梯度洗脫，硅膠(GF₂₅₄)薄層色譜檢測，以CHCl₃-CH₃OH-CH₃COOH (20∶1∶0.5)為展開劑，紫外燈254nm下檢視。收集溜份，減壓蒸去溶劑，得到兩個產(chǎn)物，干燥，得水飛薊賓-3,23-二琥珀酸單酯(化合物1)0.15g和水飛薊賓-3-二琥珀酸單酯(化合物2)0.12g，產(chǎn)率分別為51.8%和35.3%。

化合物1：

水飛薊賓-3,23-二琥珀酸單酯；白色固體mp:115~117℃; UV(MeOH)λmaxnm: 283,232; IR(KBr)cm-1: 3416(OH), 2925(CH2), 2370, 2335, 1737(C=O), 1641(ArH), 1512(ArH), 1465(ArH), 1371(CH₃), 1276(O-Ar), 1161, 1086, 1030, 997, 827, 644. 1H-NMR(500Hz, DMSOδ ppm): 12.20 (2H, br, 2×-COOH), 11.42(1H, s, 5-OH), 10.99(1H, s, 7-OH), 9.19(1H, s, 20-OH), 7.17 (1H, d, J=2.0Hz, 13-H), 7.07-6.96(m, 15-H, 16-H, 18-H), 6.87(1H, dd, J=8.2, 1.8Hz, 22-H), 6.81(1H, d, J=8.2Hz, 21-H), 5.96(1H, d, J=2.2Hz, 6-H), 5.90-5.94(2H, m, 8-H, 2-H),5.53 (1H, d, J=11.6Hz, 3-H), 4.95(1H, d, J=8.0Hz, 11-H), 4.51(1H, m, 10-H), 4.12 (1H, m, 23a-H), 3.95 (1H, dd, J=12.2Hz, 4.6Hz, 23b-H), 3.78(3H, s, 19-OCH₃), 2.38-2.64(8H, m, 2×-CH₂CH₂-)

化合物2：

水飛薊賓-3-琥珀酸單酯白色固體；mp: 169~172℃; UV(MeOH)λmaxnm: 285,232; IR(KBr)cm^-1: 3421(OH), 2925(CH₂), 2640, 1714(C=O), 1640(ArH), 1511(ArH), 1424(CH₂), 1378(CH₃), 1277, 1163, 1088, 1031 828, 641; 1H-NMR (500Hz, DMSOδ ppm)： 12.23(1H, br, 3-COOH), 11.5 (1H, s, 5-OH), 11.1(1H, br, 7-OH), 9.20(1H, s, 20-OH), 7.20 (1H, d, J=1.8Hz, 13-H), 7.03-7.09 (1H, m, 15-H, 16-H, 18-H), 6.94 (1H, J=8.2 Hz, 1.8Hz, 22-H), 6.88(1H, d, J=8.2Hz, 21-H), 6.03 (1H, d, J=2.1Hz, 6-H), 6.01-5.96(2H, m, 8-H, 2-H), 5.58 (1H, d, J=11.6Hz, 3-H), 4.99(1H, d, J=8.0Hz, 11-H), 4.26(1H, m, 10-H), 3.86(s, 3H, 19-OCH₃), 3.64(1H, m, 23a-H), 3.43(m, 1H, 23b-H), 2.47-2.72(4H, m, -CH₂CH₂-)

2 保肝活性研究

由于化合物1和2均為含羧基的水飛薊賓衍生物，因此考慮將化合物1和2分別制成水溶性較好的鈉鹽，并通過尾靜脈給藥方式考察化合物1和2的保肝作用。

2.1 材料及方法

2.1.1 材料

甘利欣注射液：10mL/50mg，江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H10940190。

水飛薊賓-3,23-二琥珀酸單酯(SD), 純度95.00%;水飛薊賓-3-二琥珀酸單酯(SS), 純度99.09%。

SD給藥量高劑量為91.0mg/kg，低劑量為45.5 mg/kg，SS高低劑量根據(jù)化合物1等摩爾濃度分別配制。

配置方法：分別稱取化SD 455.1mg、227.5mg SS（純度99.09%）388.9mg、194.4mg至50mL容量瓶中，加10%的氫氧化鈉溶液溶解，并用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH=7，加0.9%NaCl溶液稀釋至20mL。臨用前用0.2μm微孔濾膜過濾除菌。

四氯化碳，批號20071008，上海久億化學(xué)試劑有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT)檢測試劑盒，批號20071217，南京建成生物工程研究所；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測試劑盒，批號20071217，南京建成生物工程研究所。

2.1.2 主要儀器

UV 754-型紫外可見光分光光度計，上海第三分析儀器廠；LD25-2型離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)動物

昆明種小鼠，雄性，體重(20.0±2.0)g，南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

2.1.4 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠急性CC14肝損傷模型的建立：將CCl4于色拉油中超聲溶解制成5%的溶液。正常對照組僅腹腔注射色拉油20mL/kg，其它各實(shí)驗(yàn)組小鼠按20mL/kg腹腔注射5%CC14色拉油溶液，禁食，不禁水。

2.1.5 動物分組及藥物處理^[5]

將小鼠隨機(jī)分為7組，即正常組（尾靜脈注射生理鹽水）、模型組（尾靜脈注射生理鹽水）、陽性藥物組（0.5%甘利欣注射液100mg/kg）、SD（高劑量）組（91.0mg/kg）、SD鈉鹽溶液（低劑量）組（45.5mg/kg）、SS（高劑量）組（77.6mg/kg）、SS（低劑量）組（38.8mg/kg）。正常組10只，其余各組15只。給藥組每天按設(shè)定劑量尾靜脈注射給藥2次，上午、下午各1次；空白組與CCL₄模型組給予等量的溶媒（生理鹽水），第1天上午給藥1h后，腹腔注射給予5%的CCL₄色拉油溶液，空白組腹腔注射給予等量的溶媒（色拉油），下午給藥后禁食不禁水，第2天上午給藥1h后取血，3000r/min離心10min，分離血清， 應(yīng)用丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）測定試劑盒，在754-型紫外可見分光光度計505nm處測定吸收度，計算血清ALT、 AST值，第3天下午給藥后禁食，不禁水，第4天上午給藥1h后取血，ALT、AST值測定方法同上。

2.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)用±s表示，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理,兩均數(shù)間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2.3 結(jié)果

24h ALT、AST活性的變化見表1，72h ALT、AST活性的變化見表2。

結(jié)果顯示，造模24h后，模型組與正常組比較動物血清ALT、AST值升高（P<0.01）；甘利欣對照組與模型組相比較ALT、AST值沒有變化；SS高劑量組與模型組比較動物血清ALT值降低（P<0.01），AST值降低（P<0.01）；SD低劑量組動物ALT值降低（P<0.05）。各組小鼠均無死亡。造模72h后，模型組與正常組比較ALT、AST值升高（P<0.01）；甘利欣對照組與模型組比較ALT、AST值降低（P<0.01）；藥物組與模型組比較ALT、AST值均沒有降低。造模72h后，甘利欣組和模型組均死亡率相同，SD和SS相比甘利欣和模型組死亡率均下降。

注：*（P<0.01），**（P<0.05）。

3 討論

兩個產(chǎn)物分別在水飛薊賓的3位和3，23位與丁二酸酐酯化得到，說明醇羥基比酚羥基更活潑，容易與丁二酸酐發(fā)生反應(yīng)。所合成化合物1鈉鹽和化合物2鈉鹽均能降低四氯化碳急性肝損傷小鼠的血清ALT值，表明化合物1鈉鹽和化合物2鈉鹽對受損及處于受損的肝細(xì)胞有保護(hù)和修復(fù)作用。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Hikinl H,Kiso Y,Wagner H,etal.Antihe patotoxi cactions of flavonolignans form Silybum marianum fruits［J］.PlantaMed,1984,50(3):248-250.

［2］ 任孟軍,左國慶,何松.水飛薊賓對人肝癌細(xì)胞株ＨｅｐＧ2增殖的影響及其機(jī)制研究［J］. 重慶醫(yī)學(xué),2005,34(3):369-372.

［3］ 肖莉, 靳淑敏, 張麗霞，等. 水飛薊素制劑及其應(yīng)用進(jìn)展［J］. 中國藥物與臨床,2005,5(3):205-208.

［4］ Pelter, Andrew Hansel, Rudolf. Structure of silybin. I. Degradative experiments［J］. Chemische Berichte, 1975, 108 (3): 790-802.

［5］ 楊錯, 劉玉蘭, 張紅梅.柴胡乳劑對急性化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2006，23(2): 105-108.

（責(zé)任編輯：姜付平）