復(fù)方瘡瘍搽劑中沒(méi)食子酸的含量測(cè)定

何方方

（河南省醫(yī)藥學(xué)校，河南 開(kāi)封 475001）お

摘 要：目的：建立復(fù)方瘡瘍搽劑中沒(méi)食子酸的含量測(cè)定方法。方法：采用HPLC,Kromasil C18色譜柱,流動(dòng)相甲醇-0.025%磷酸水溶液(4∶96),柱溫；25℃，流速1mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)275nm。結(jié)果：相關(guān)系數(shù)r=0.99972,精密度RSD為0.42%，平均加樣回收率為99.1%，RSD為0.91%，結(jié)果示線性關(guān)系良好。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單,分離效果好,可用于復(fù)方瘡瘍搽劑的質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞：復(fù)方瘡瘍搽劑；沒(méi)食子酸；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：R927.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2009）01-0040-02

復(fù)方瘡瘍搽劑由金銀花、大黃、五倍子、柯子、當(dāng)歸、黃柏、烏梅等組成。具有清熱解毒、斂瘡止血、抗菌消炎的功效。主要用于治療各種潰瘍、外傷出血、癰、腫、疔、癤等癥。方中五倍子、柯子、烏梅具有收斂止血、抗菌消炎之功效,其主要成分為沒(méi)食子酸，為瘡瘍搽劑中的有效成分之一。本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品預(yù)處理后，用甲醇回流提取，采用HPLC 法對(duì)瘡瘍搽劑中的沒(méi)食子酸進(jìn)行含量測(cè)定,以對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制。本法取樣量少，操作簡(jiǎn)便，精密度高，分離良好。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀; KromasilC18色譜柱;G1315B DAD檢測(cè)器；自動(dòng)進(jìn)樣器；四元泵；Agilent 1100 化學(xué)工作站。

1.2 試藥

沒(méi)食子酸對(duì)照品(0831-9501):中國(guó)藥品生物制品鑒定所;樣品:自制(批號(hào):000213，000214，000215，000216，000217) ；甲醇：色譜純（天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；磷酸：分析純（廣東汕頭西隴化工廠）；所有色譜用試劑均用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾；水為重蒸餾水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱 KromasilC18 250×4.6mm 5μm;流動(dòng)相: 甲醇-0.025%磷酸水溶液(4∶96)^[1];流速1mL/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量:1μL；分析方法:外標(biāo)法。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量,用流動(dòng)相溶解并稀釋,于200～400nm 處進(jìn)行UV 掃描,從其紫外圖譜中可見(jiàn)其在220nm、275 nm 處有最大吸收,但在220nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，流動(dòng)相中甲醇及樣品中其他物質(zhì)的紫外吸收干擾較大，基線不穩(wěn)，故選擇275 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別按照2.5、2.6項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液及供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，各進(jìn)樣5μm，同時(shí)采集200~400nm光譜數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，供試品溶液相應(yīng)色譜峰的光譜與對(duì)照品沒(méi)食子酸一致，并經(jīng)Agilent 1100 化學(xué)工作站純度分析，色譜峰純度符合規(guī)定。沒(méi)食子酸對(duì)照品保留時(shí)間為10.7min，理論塔板數(shù)大于3 000。故將最小理論塔板數(shù)定為不低于3 000 。2.4 流動(dòng)相的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道沒(méi)食子酸的測(cè)定方法很多，主要以薄層掃描法和高效液相色譜法^[2、3]為主。參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法試驗(yàn)，流動(dòng)相用甲醇-水（5∶95）,水-乙酸（98∶2），甲醇-冰醋酸-N，N二甲基酰胺-水（1∶3∶15∶81）^[4]，甲醇-0.5%冰醋酸（15∶85），在該制劑中沒(méi)食子酸的分離效果均不佳，初步選擇甲醇-0.025%磷酸水溶液（30∶70）作流動(dòng)相，沒(méi)食子酸與其他組分色譜峰分離雖然較前幾種流動(dòng)相效果好，但仍不佳，考慮到?jīng)]食子酸顯酸性，故流動(dòng)相的pH值對(duì)沒(méi)食子酸的分離影響較大^[5]，通過(guò)不斷改變甲醇與磷酸水溶液的比例及流速，選定甲醇-0.025%磷酸水溶液(4∶96)及流速1mL/min比較合適，分離度好且保留時(shí)間適宜，而且在不斷調(diào)節(jié)pH值的過(guò)程中證明流動(dòng)相的pH值確實(shí)對(duì)沒(méi)食子酸的分離影響較大。

2.5 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取減壓干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品,加甲醇制成0. 108mg/mL的溶液,作為對(duì)照品溶液。供試品溶液的配制精密吸取樣品(批號(hào):000213)10mL，水浴蒸干加甲醇10mL超聲處理300min，濾過(guò),甲醇定容于10mL容量瓶中,搖勻即得。

2.6 供試品溶液的配制

精密吸取樣品(批號(hào):000213) 10mL，用1mol/L NaOH調(diào)pH值至7，過(guò)濾，濾液用氯仿萃取3次，每次10mL;棄去氯仿液，水液用稀鹽酸調(diào)pH值至3，過(guò)濾，濾液水浴蒸干；40mL甲醇回流30min,放冷，濾過(guò)，回收甲醇，定容于10mL容量瓶中，以0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，備用。

2.7 線性關(guān)系考察

精密吸取上述對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10μL進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量(μg) 為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)。測(cè)定結(jié)果,得到回歸方程為：Y = 4118.381X + 12.277854,相關(guān)系數(shù)：r=0.999 7，線性范圍：0.1038～1.038 2μg。

2.8 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液5μL，重復(fù)進(jìn)樣5 次,進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果峰面積的RSD(n=5)=0.42%。證明本法有較高的精密度（見(jiàn)表1）。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)本品（000213），按供試品項(xiàng)下方法處理后，分別于0、1、2、4、6h進(jìn)樣，進(jìn)樣量為2μL,測(cè)得其沒(méi)食子酸的平均峰面積值為2497，RSD為4.24%，表明樣品中沒(méi)食子酸的含量在6h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)本品（000214），平行制備5份樣品，按樣品測(cè)定法測(cè)定，并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果測(cè)得沒(méi)食子酸平均含量為0.326mg/mL,RSD為0.59%。

2.11 樣品測(cè)定

取5批樣品依法制得供試品溶液，進(jìn)樣量1μL,分別依法測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算沒(méi)食子酸含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.12 加樣收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取已知含量的樣品(批號(hào)為000216)10mL，分別加入沒(méi)食子酸對(duì)照品,依法處理制成供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表3,表明樣品中其他成分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響 。

3 討論

（1）該制劑中的五倍子、柯子、烏梅、大黃中均含有沒(méi)食子酸,且這4 味藥占組方的50%，沒(méi)食子酸又是其中一種有效成分。故為了保證藥品質(zhì)量及療效,必須測(cè)定沒(méi)食子酸的含量。

（2）樣品提取時(shí)，根據(jù)沒(méi)食子酸的溶解性及參考文獻(xiàn)，選用甲醇回流，放置過(guò)夜，超聲處理進(jìn)行比較，結(jié)果表明甲醇回流效果最佳。對(duì)回流30、40、60min的結(jié)果比較，表明沒(méi)食子酸含量相差不大，故選用回流30min提取。

（3）由于沒(méi)食子酸為可水解鞣質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，本篇樣品中沒(méi)食子酸的提取采用甲醇回流加熱提取，使樣品中可水解鞣質(zhì)水解出沒(méi)食子酸，因此本篇測(cè)定的是樣品中的游離沒(méi)食子酸和水解出的沒(méi)食子酸的總量之和^[6]。若采用超聲提取，提取的主要為游離沒(méi)食子酸，含量較低。

本篇通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，建立了瘡瘍搽劑中沒(méi)食子酸含量的HPLC測(cè)定法，本法取樣量少，方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為質(zhì)量控制分析方法，為沒(méi)食子酸的含量測(cè)定提供了一種可借鑒的、行之有效的方法。

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（責(zé)任編輯：陳涌濤）