時間分辨熒光免疫分析法測定甲胎蛋白的臨床評價

霍繼煒

（撫順市中心醫院，遼寧 撫順 113006）お

摘 要：目的：評價時間分辨熒光免疫分析法測定甲胎蛋白的臨床應用價值。方法：分別用時間分辨熒光免疫分析法和酶聯免疫吸附法進行AFP測定，進行相關性分析、精密度試驗和線性分析。結果：兩法呈正相關，都有較好的重復性，但時間分辨熒光免疫分析法的CV值明顯小于酶聯免疫吸附法，時間分辨熒光免疫分析法比酶聯免疫吸附法具有更寬的檢測范圍。結論：應用時間分辨熒光免疫分析法檢測AFP，具有靈敏度高、重復性好、穩定性強等優點，有著良好的發展前景。

關鍵詞：甲胎蛋白；時間分辨熒光免疫分析；酶聯免疫吸附

中圖分類號：R446.6文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）03-0104-02

甲胎蛋白（AFP）是胚胎發育早期的一種主要血清蛋白，分子量約68000，由96％蛋白質和4％的碳水化合物組成，成人由肝細胞產生，血清中含量極微。AFP是診斷肝癌最特異的標志物^[1]，其靈敏度和特異性已經達到甚至遠遠超過CT、MRT、同位素掃描、超聲波檢查和血清酶學檢查，同時檢測孕婦血清中的AFP含量可用于神經管缺損畸胎的篩查。這些領域均須對AFP進行定量測定，臨床上檢測AFP的方法有很多，本文采用時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）和酶聯免疫吸附法（ELISA）對65份血清進行AFP測定，報告如下。

1 材料與方法

1.1 病人與標本

本院2007年8月-12月收治的65例肝癌患者，血清學AFP檢測陽性，經影像學、組織病理學檢查確診為原發性肝癌，抽取肝癌住院患者晨血5mL，EDTA抗凝。將其中15份血清混合后分裝（用于精密度試驗），置于-20℃冰箱中保存，集中測試。

1.2 儀器與試劑

TRFIA采用WALLAC公司生產的AutoDELFIA1235型全自動時間分辨熒光分析儀，測定試劑盒為蘇州新波生物技術有限公司生產，自帶標準物，檢測過程均按照試劑盒說明書進行操作，ELISA采用美國Bioeheek公司產品，定量試劑盒為鄭州博賽生物工程有限責任公司生產。

1.3 檢測方法

（1）TRFIA。AFP標準品和樣品25μL／孔→分析緩沖液200μL→室溫慢速振動60min→洗板2次→已稀釋（1∶50）的Eu3+標記溶液200μL→室溫慢速振動60min→洗板6次→增強液200μL→室溫慢速振動孵育5min→測定熒光值，自動計算AFP值。

（2）ELISA。稀釋液100μL/孔→血清樣本20μL→37℃孵育30min→洗板4次→酶標抗體150μL/孔→37℃孵育30min→洗板→顯色→酶標儀450nm讀數測定，自動擬合曲線并計算AFP含量。

1.4 統計學分析

用SPSS13.0進行數據整理和統計分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 相關性分析

用上述兩種方法對50份受檢血清進行AFP定量分析，測定結果作相關性分析，結果表明，兩種方法差異無顯著性（P>0．05），直線回歸方程為：Y（TRFIA）=0.938X（ELISA）+0.988，r=0.94，兩法呈正相關。

2.2 精密度試驗

參照NCCLS的精密度評價方案^[2]，用時間分辨熒光免疫分析法和酶聯免疫吸附法分別對高、中、低3個濃度（參考值分別為800μg／L，170μg／L，5μg／L）的AFP質控血清進行重復性試驗。結果顯示，兩種方法都有較好的重復性，但時間分辨熒光免疫分析法的CV值明顯小于酶聯免疫吸附法，見表1。

2.3 線性分析

取高值混合血清作6點倍比稀釋，各復測3次，以原倍血清測定值為標準按稀釋倍數算得其理論值，與兩種方法實際測定值比較進行線性分析，TRFIA回歸方程為：Y=1.04X+7.26，r=0.96；ELISA回歸方程為：Y=0.63X+45.31，r=0.91。TRFIA在0.72～1078ng／L范圍內線性良好；ELISA在4.21～535ng／L范圍內線性良好。時間分辨熒光免疫分析法比酶聯免疫吸附法具有更寬的檢測范圍。

3 討論

時間分辨熒光免疫測定的基本原理是以鑭系元素銪（Eu）螯合物作為熒光標記物，利用這類熒光物質壽命長的特點，延長熒光測量時間，待短壽命的自然本底熒光完全衰退后再行測定，所得信號完全為長壽命鑭系螯合物的熒光，從而有效排除非特異性本底熒光的干擾而提高靈敏度。TRFIA法的固相技術，也是保持其靈敏度的一個重要因素，同時增強液在TRFIA中的作用特別重要，優質的增強液是提高檢測靈敏度的另一個關鍵因素，加入增強液后，可以使Eu3+從反應復合物中解離下來，游離的Eu3+同增強液中的另一種螯合劑形成一種膠態分子團，這種分子團在激發光的激發下能夠發出強烈熒光，信號可以增強100萬倍^[3]。TRFIA法的批內、批間精密度均比ELISA法好，這可能是由于TRFIA法利用了具有獨特熒光特性的鑭系元素及其螯合物為示蹤物，幾乎完全消除了背景熒光的干擾，且試劑穩定性好，因而檢測重現性好；ELISA法檢測影響因素較多，另外，ELISA法定量AFP試劑盒的線性及標準問題是測定結果準確性的關鍵，ELISA法的“鉤狀效應”，即測定顯色隨著待測標本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后，測定吸光度隨抗原濃度的增加而開始下降至不顯色，容易造成假陰性結果。另外，TRFIA的線性范圍更寬，也是因為TRFIA采用Eu3+作標記物，由于Eu3+發光信號具有寬線性，同時采用獨特的熒光解離增強技術，即通過加入增強液，標記物Eu3+在DELFIA體系中有非常優良的可檢測性，大大提高了TRFIA的檢測線性?？傊?，應用時間分辨熒光免疫分析法檢測AFP，具有靈敏度高、重復性好、穩定性好等優點，有著良好的發展前景。

參考文獻：

［1］ 劉寶善.消化器官腫瘤學［M］.北京：人民衛生出版社，2004：475．

［2］ 楊昌國，許葉，張抗．精密度評價和方法比較中NCCLS評價方案的應用［J］．臨床檢驗雜志，1999，17（1）：47-49．

［3］ 杭建峰，吳英松，李明．時間分辨熒光免疫分析的研究進展及應用［J］．熱帶醫學雜志，2004，4（3）：340-342．

（責任編輯：姜付平）