補體C3在周圍神經再生條件液中的存在及其神經生物學活性的研究

孟繁君 李青峰 李玉萍 謝 峰 昝 濤 鄭 丹 寧翁瑞 楊 湄 李 華

補體C3在周圍神經再生條件液中的存在及其神經生物學活性的研究

孟繁君 李青峰 李玉萍 謝 峰 昝 濤 鄭 丹 寧翁瑞 楊 湄 李 華

目的鑒定分析神經再生條件液(Nerve regeneration conditioned fluid，NRCF)中相對分子質量為(232～440)×103區域的蛋白條帶，并探索NRCF中補體C3可能的促神經再生作用。方法采用Shotgun蛋白質組學策略、液相色譜一串聯質譜對相對分子質量為(232～440)×103區域的蛋白條帶的組分進行定性分析。在原代培養的皮層神經元中分別加入不同濃度的外源性補體C3蛋白和神經生長因子，以Neurolucida神經元分析軟件采集各實驗組每個大腦皮層神經元最長突起長度。結果NRCF中相對分子質量在(232～440)×103的蛋白條帶共鑒定到54種蛋白質，其中包括補體C3 α鏈，補體C3 α鏈和神經突起導向因子Netrins結構中都含有一個共同功能域NTR組件。培養液加入特定濃度補體C3 (0.5～5 μg/mL)后培養96 h的神經元突起長度較正常對照組顯著增長（P＜0.05）。結論補體C3存在于NRCF中，特定濃度補體C3對神經元突起有明顯促進生長作用，NRCF中的補體C3可能對神經的再生有促進作用

神經再生條件液神經再生補體C3神經突

周圍神經損傷時,在神經遠、近兩斷端間橋接一硅膠管，形成的密閉間隔稱之為神經再生室。再生室所形成的再生微環境及其中的主要成分—神經再生條件液(Nerve regeneration conditioned fluid，NRCF)，是神經再生自我調控、自我完善機制充分發揮的重要條件[1]。在我們前期工作中用鳥槍(Shotgun)蛋白質組學策略對NRCF中相對分子質量在(232～440)×103條蛋白帶進行質普分析并進行了生物學分類，證實了Shotgun蛋白質組學策略對NRCF中蛋白成分分析的有效性和可行性[2]。我們在對NRCF中蛋白成分分析的基礎上，利用蛋白數據庫篩選有神經生物學活性的蛋白，發現NRCF中含有補體C3 α鏈，提示補體C3在NRCF中的存在[5]。

補體作為免疫系統的重要組成部分，在參與機體抗微生物防御反應以及免疫調節中發揮重要作用，補體C3是血漿中濃度最高的補體蛋白(1.0～1.2 mg/mL)。近年來，研究表明補體C3和其激活片段C3a在中樞神經系統中有著許多與免疫無關的作用：補體C3活性片段C3a和其受體C3aR對小腦發育過程中神經細胞的遷移有重要影響[3]。補體C3基因缺陷的小鼠大腦神經元無論是發育過程中還是腦缺血性損傷后的增殖能力明顯下降[4]。但補體C3是否與周圍神經的修復有一定聯系，以及是否對神經元突起的生長有促進作用，卻鮮有報道。我們進行補體C3對神經元突起生長影響的研究，發現特定濃度的補體C3對神經元突起有明顯的促進作用，提示補體C3可能對神經的再生有促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料

新西蘭大白兔6只，體重1.8～2.5 Kg，雌雄不限（上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物實驗室提供），SD大鼠胚胎（胎齡16 d)（孕鼠由中國科學院上海生命科學院動物中心提供）。

內徑3 mm外徑5 mm硅膠管(上海新亞醫用橡膠廠)；聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑（Bio-Rad公司）；自然膠電泳高分子量標準試劑盒(Amersham公司)；神經元基礎培養液Neurobasal Medium、2.5 S-神經生長因子（Invitrogen公司）；其余神經元培養用試劑均購自Gibco公司；Complement C3（Calbiochem公司）；小型垂直平板電泳設備（Bio-Rad公司）；LCQ DECA XP plus及Sequest軟件（Thermo Finnigan公司）；C18反相柱（180 mm×150 mm×5 μm）（Thermo Hypersil-Keystone公司）；6孔細胞培養板（Corning公司）；聚丙乙烯塑料離心管（NUNC公司）；超凈工作臺（上海凈化設備廠）；水平離心機（Heraeus公司）；恒溫CO2培養箱（Heraeus公司）；解剖顯微鏡（Leica公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司）；Scion Image分析軟件（Scion公司）。

1.2 NRCF蛋白組分分析

1.2.1 實驗動物與模型的建立

速眠新、氯氨酮肌注麻醉大白兔后，手術暴露雙側坐骨神經。游離坐骨神經約50 mm，從中間剪斷，兩斷端用7-0縫線吻合已消毒的醫用硅膠管1根(內徑3 mm、長40 mm)。中間間隙為25 mm，形成約100 μL的兔坐骨神經再生室模型，6只大白兔共建立12個再生室模型。

1.2.2 NRCF自然聚丙烯酰胺凝膠電泳(Nativepolyacrylamide gel electrophoresis，Native—PAGE）分析

術后7 d，用50 μL微量注射器抽盡神經再生室中NRCF，每一個神經再生室抽得NRCF 50～100 μL，共獲取約900 μL。分別置入無菌Eppendorf管中，每管150 μL，-70℃低溫保存備用，Native-PAGE電泳均采用上述獲取的NRCF樣品。配制非變性PAGE分離膠和非變性PAGE濃縮膠，取高速離心后樣品上清10 μL，加入2.5 μL的5倍加樣緩沖液混合后上樣，并同時加入非變性膠的高相對分子Marker 10 μL，12 mA條件下電泳30 min，然后15 mA電泳直至溴酚藍到達底部前沿，電泳全過程在冰浴中進行?？捡R斯亮藍R-350考染。以上電泳實驗重復3次。

1.2.3 （232～440）×103區域的蛋白條帶的鳥槍蛋白質組學分析

切取相對分子質量在（232～440）×103區域的蛋白條帶約300 μg，將其溶于100 μL變性溶劑(6 mol/L鹽酸胍，50 mmol/L Tris-HC1緩沖液，pH 8.3)，加入1 mol/L二硫蘇糖醇1 μL，37℃，2.5 h；加入1 mol/L碘乙酰胺5 μL，室溫，避光，40 min。置入截留分子量為3 000的超濾管，加入100 mmol/L NaHCO3200 μL，4℃，12 000 r/min超濾1.5 h；重復上述步驟3～4次，最后超濾至膜上溶液少于20 μL。取新的套管，倒置超濾管，12000 r/min離心約5 min。將超濾好的樣品用100 mmol/L NaHCO3稀釋至100 μL，混合，離心。加入約6 μg胰蛋白酶(Promega，37℃，18～20 h）置入截留分子量為10 000的超濾管，4℃，12 000r/min超濾1 h，將膜上液體超濾除去。將超濾至套管中的溶液凍干至少于15 μL。

上樣進行LC-MS(儀器型號為LCQ DECA XP-plus)：用0.1%甲酸將樣品稀釋至51 μL，上樣3次。RP-C18反相柱(180 μm×150 mm×5 μm），流速200 μL/min，分流比1:100，溶液A(0.1甲酸)，溶液B (0.1乙氰)，梯度360 min線性2%～85%。采用1個全掃描后緊跟3個MS的模式，得到電噴霧離子化(Electrospray ionization，ESI)質譜總離子流圖譜和二級質譜圖譜。應用Sequest軟件分析質譜數據，對照國家生物技術信息中心(Mational center for biotechnology information，NCBI)LAGOMORPHA(兔形目)蛋白數據庫。Sequest結果：過濾參數為，當Charge+1，Xcorr≥1.9；當Charge+2，Xcorr≥2.2；當Charge+3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0。

應用同源性搜索、結構預測和結構鑒定等方法篩選鑒定結果的54種蛋白質中可能具有神經生物活性的蛋白。根據Identified Name（包括gi、sp、gb、emb、pir、prf、dbj、pdb等）在InterPro、SMART、Pfam等蛋白質數據庫中查詢分析。

1.3 補體C3對神經元突起的影響的觀測

1.3.1 皮層神經元分離及原代培養

取孕16 d的SD大鼠，乙醚麻醉后取胚胎；解剖鏡下解剖出大腦皮層，去腦膜；剪碎大腦皮層，加0.05%胰蛋白酶于37°C孵育箱消化10 min，接種培養基（DMEM+10%胎牛血清+5%馬血清）中止消化后，將組織吹打懸浮成單細胞，以1×104cells/cm2接種于已置入包被好玻片的6孔培養板，第2天更換后續培養基[Neurobasal Medium+2%B-27 Supplement +Glutamine（2 mmol/L）]。

1.3.2 神經元分組處理

分組：①正常對照組，不加入其他試劑；②NGF陽性對照組，細胞培養第2天加入神經生長因子NGF，終濃度為100 ng/mL；③補體C3實驗組：細胞培養第2天加入補體C3，終濃度為：0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL。

各組在37℃、5%CO2條件下孵育培養，每日更換新鮮培養液并重新加入各自相應實驗因素，培養至96 h。從各實驗組隨機選取生長良好、神經突與周邊細胞無交錯的神經元，每組各300個，分3次實驗。用Scion Image分析軟件采集各組大腦皮層神經元的突起長度。

1.4 數據分析和統計

數據以（均值±標準誤）表示。進行單因素方差分析(Oneway-ANOVA)，實驗組各種濃度結果均與對照組之間行組間兩兩比較，P＜0.05代表有統計學意義，P＜0.01代表有高度統計學意義。

2 結果

2.1 Native-PAGE電泳結果

重復3次電泳得到的NRCF蛋白質圖譜非常相似。NRCF經Native-PAGE電泳分離，相對分子質量在669×103以上有1條蛋白帶，在相對分子質量為(67～669)×103區域存在多條蛋白帶(圖1)，相對分子質量在(232～440)×103有1條蛋白帶，相對分子質量在(140～232)×103有1條蛋白帶，相對分子質量在(67～140)×103有6條蛋白帶，在含量上占NRCF的大部分。

2.2 Shotgun蛋白質組學鑒定

針對Native-PA GE膠上相對分子質量在(232～440)×103的蛋白條帶，切膠酶解，進一步使用電噴霧離子阱質譜（ESI-IT-MS）進行Shotgun蛋白鑒定，獲得該蛋白條帶的ESI質譜總離子流圖譜和二級質譜圖譜；Sequest軟件分析質譜數據，比對NCBI LAGOMORPHA蛋白數據庫，共鑒定到54種蛋白，其中含有補體C3 α鏈，其質譜ig號為116596，鑒定肽段數為81，唯一肽段數為21，這表明NRCF中含有補體C3[5]。對鑒定到的54種蛋白質在InterPro、SMART、Pfam等數據庫中應用同源性搜索、結構預測和結構鑒定等方法篩選具有神經生物活性的蛋白。結果發現在本實驗質譜結果中的C3 α鏈與已知的神經突起生長導向因子（Netrins）C端具有同源性功能域NTR組件。

2.3 補體C3對神經元突起生長的影響

神經元培養第2天，見絕大多數神經元形態飽滿，狀態良好，部分神經元有細小突起長出。培養后96 h鏡下示各組神經元突起已經非常明顯，其中補體C3 0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL濃度組、NGF陽性對照組各組間神經突無明顯差別，但明顯較正常對照組和其它C3濃度組神經元生長狀態更為旺盛，突起更長（圖2）；補體C3 0.1 μg/mL、0.2 μg/mL濃度組、正常對照組間神經突無明顯差別。

2.4 數據分析和統計結果

3次實驗圖像測得正常對照組、NGF陽性對照組、補體C3 0.1 μg/ml、0.2 μg/mL、0.5 μg/ml、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL濃度組神經突平均長度分別為420.78 μm、485.79 μm、428.95 μm、430.46 μm、480.12 μm、567.82 μm、574.60 μm、569.24 μm。統計學Oneway-ANOVA分析，NGF陽性對照組、補體C3 0.5 μg/mL濃度組神經元突起與正常對照組間差異有統計學意義(P＜0.05)，平均長度較正常對照組分別增長14.2%和15.4%，補體C3 1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL濃度組神經元突起長度與正常對照組間有高度統計學意義（P＜0.01），平均長度較正常對照組分別增長34.9%、36.5%和35.2%，但補體C3 1.0 μg/ml、2.0 μg/ml、5.0 μg/ml濃度組間差別無統計學意義；0.1 μg/ml、0.2 μg/ml與正常對照組神經間差別無統計學意義（P＞0.05）（圖3)。

圖1 神經再生條件液的自然膠電泳圖譜

圖3 培養96 h各組神經元神經突長度比較

3 討論

周圍神經損傷的修復與再生是一個復雜的生理過程，雖然顯微縫合技術可以較好地恢復神經的連續性，但神經功能的恢復仍不令人滿意[6-7]。隨著近年來分子生物學研究的深入，人們發現神經再生具有自我調控和自我完善的能力，而再生微環境則是這一能力發揮與否的關鍵[8]。由Lundborg等[9]最早提出的神經再生室模型，為研究周圍神經損傷后的再生機制提供了一個相對隔離的微環境，是公認的研究周圍神經再生微環境的良好工具，然而目前對神經再生室內微環境的作用機制尚不清楚。NRCF體現了早期周圍神經再生微環境的特征，使對NRCF的研究成為神經再生機制的一個重要途徑[10]。本實驗對NRCF中微量蛋白成分的分析有助于了解NRCF的性質和作用，為進一步尋找NRCF中能促進神經再生的蛋白，從而為改進目前的神經修復治療方法奠定基礎。

圖2 培養96 h后，各組神經元生長情況（100×）

由于NRCF中的蛋白成分極其微量，對其分離和檢測十分困難。目前對于NRCF的分析,大多停留在對其中某種或幾種成分的分析，尚罕見對再生微環境進行總體的、系統的分析和報道。李青峰等[11]采用Native PAGE分離NRCF中蛋白成分，將含有不同蛋白條帶的電泳凝膠塊分別與背根神經節共培養進行活性鑒定，發現在含有相對分子質量為（232～440）×103間的蛋白具有明顯的神經營養和趨化活性，能促使后根神經節突起向其生長。因此，我們的實驗對該目標蛋白作進一步研究分析。

LC-MS／MS聯用，即鳥槍蛋白質組學策略分析鑒定蛋白質混合物，是近年來發展迅速的非凝膠新方法[12]，是將蛋白質酶解片段混合物先后通過不同的色譜柱(如離子交換柱和反相柱)分離，分離的肽片段直接進入質譜儀進行一級質譜和二級串聯質譜分析，得到肽段質量和部分碎片離子及序列的信息，最后通過計算機處理和聯網查詢對蛋白質進行鑒定[13]。前期工作中我們已經應用鳥槍蛋白質組學策略對NRCF中相對分子質量為（232～440）×103間的目標蛋白條帶進行了成分鑒定和生物學分類[2]，現在我們在原來鑒定出的蛋白成分基礎上，在蛋白質數據庫中應用同源性搜索、結構預測和結構鑒定等方法篩選具有神經生物活性的蛋白。結果發現本實驗鑒定出的54種蛋白成分中包含有補體C3 α鏈。補體C3激活前由α鏈和β鏈經二硫鍵相連組成，補體C3α鏈是補體C3特有的蛋白條鏈，補體C3 α鏈的存在表明NRCF中含有補體C3[5]。由于神經再生室是神經兩斷端間的密閉腔隙，故NRCF中補體C3應來源于神經斷端的分泌而非神經外的免疫系統。

在蛋白質數據庫中應用功能域篩選發現補體C3樣因子的C末端和神經突起生長導向因子家族Netrins的C末端存在同源性的功能域NTR組件。Netrins在神經系統發育過程中具有促進和導向神經突起的作用，而其功能域NTR組件在該過程中發揮關鍵作用[14]。NTR在補體C3中的存在提示補體C3可能具有和Netrins相似的神經生物學活性。大量研究表明，補體C3在神經元生長和神經系統發育中有著積極作用。Heese等[15]發現人神經膠質細胞體外培養時，加入C3a能促使其表達神經生長因子，具有促進神經元生長的作用；Van Beek等[16]發現，C3a可以在有星形膠質細胞存在時，保護神經元免遭NMDA-興奮性毒素的損害。Wyss-Coray等[17]也證實補體C3可以減輕神經損傷后的病理改變，提示補體C3可能也具有神經保護性；Rahpeymai等[4]發現補體C3或補體C3aR基因缺陷的小鼠的大腦室下區、海馬齒狀回顆粒層和嗅球區的神經增殖數目較正常小鼠有明顯下降，腦缺血性梗塞小鼠模型梗塞周邊區也觀察到類似現象。但目前補體C3對神經元突起（軸突和樹突）的生長速度有無直接影響尚不清楚。我們在培養的原代皮層神經元中加入補體C3，發現特定濃度（0.5～5 μg/mL）的補體C3對體外培養神經元突起的生長具有明顯的促進作用，提示NRCF中的補體C3可能對神經損傷后的再生具有重要意義，但此結論尚需在體內實驗中獲得證實，有待于進一步的深入研究。

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Investigation on the Detection of Complement C3 and Its Neurobiological Character in Nerve Regeneration Conditioned Fluid

MENG Fanjun,LI Qingfeng,LI Yuping,XIE Feng,ZAN Tao,ZHENG Danning,WENG Rui,YANG Mei,LI Hua.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LI Qingfeng.

ObjectiveTo explore the effects of promoting nerve regeneration of complement C3 in nerve regeneration conditioned fluid(NRCF).MethodsThe protein band of the relative molecular mass of(232-440)×103in NRCF were analyzed by the Shotgun technique,liquid chromatography and mass spectrometry(LC-MS/MS).The primary cultured cortical neurons were exposed to different concentrations of exogenous complement C3 and nerve growth factor(NGF).Photograph of neurons in each group was taken every day,and the length of the longest neurite of each neuron was calculated by a neuron morphology analysis software.The neurons without exposure to the other agents and the culture fluid were served as controls.Results54 proteins were identified in the protein band of the relative molecular mass of(232-440)×103.Complement C3 alphachain protein,which had a NTR module as well as netrins in structure,was included in these proteins.The neurites of neurons with the presence of low C3 concentrations were significant longer than the neurites of normal control group after cuturing 96 hours.ConclusionThere was complement C3 protein in NRCF.Low concentration of complement C3 has positive effect on neurites growth in cultured rat cortical neurons.It implied that the complement C3 has a positive effect of promoting nerve regeneration in NRCF.

Nerve regeneration conditioned fluid(NRCF);Nerve regeneration;Complement C3;Neurite

R622+.3

A

1673－0364（2009）－01－0016－05

2008年11月22日；

2009年1月29日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.005

國家自然科學基金（30471795）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科。

李青峰。